Name: Titration von Human Coronaviren Mit einem Immunoperoxidase Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Erfahren Sie die Titration von Human Coronaviren mit einem Immunoperoxidase-Assay. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Quantifizierung von Viren ohne zytopathische Effekte für virologische Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a> .

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

titration von human coronaviren mit einem immunoperoxidase assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Berechnung von infektiösen viralen Titer stellt eine grundlegende und wichtige experimentelle Ansatz für Virologen. Klassische Plaque-Assays können nicht für Viren, die nicht verursachen erhebliche zytopathischen Effekte, die den Fall für Stämme 229E und OC43 der menschlichen Coronavirus (HCoV) verwendet werden. Eine alternative indirekte Immunperoxidase Assay (IPA) wird hier für den Nachweis und die Titration von diesen Viren beschrieben. Empfängliche Zellen mit seriellen Verdünnungen logarithmischen von Proben in einem 96-Well-Platte ausgesät. Nach viralen Wachstums ergibt Virusnachweis durch IPA das infektiöse Virus-Titer, als &quot;Tissue Culture Infectious Dose&quot; (TCID50) ausgedrückt. Dies entspricht der Verdünnung eines Virus-haltige Probe bei der die Hälfte einer Reihe von Labor-Brunnen enthalten replizierende Virus. Diese Technik ist eine zuverlässige Methode für die Titration von HCoV in biologischen Proben (Zellen, Gewebe oder Flüssigkeiten).

In diesem Video zeigen wir eine alternative Methode für den Nachweis und Titrierung von Viren mit Hilfe einer enzymatischen Antigennachweis Technik als Immunperoxidase Test bekannt. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie Ihre virale Proben zu sammeln, bereiten die Zellen für die Prüfung und schließlich die Immunperoxidase Assay unter Verwendung von Verdünnungsreihen der virale Titer zu bestimmen.

Titration von Human Coronaviren Mit einem Immunoperoxidase Assay

Die Bestimmung infektiöser Virustiter ist ein grundlegender und essenzieller experimenteller Ansatz für Virologen. Klassische Plaque-Assays können nicht für ...

Die Berechnung infektiöser viraler Titer ist ein grundlegender experimenteller Ansatz. Die klassische Methode mittels Plaque-Assays ist jedoch nicht die zuverlässigste für Viren, die keine zytopathischen Effekte hervorrufen, wie beispielsweise humane Coronaviren. In diesem Video stellen wir eine alternative Methode zur Detektion und Titrierung eines Virus mithilfe einer enzymatischen Antigenerkennungstechnik vor, die als Immunperoxidase-Assay bekannt ist.Hier zeigen wir Ihnen, wie man virale Proben sammelt, die Zellen für die Untersuchung vorbereitet und schließlich den Immuno-Peroxidase-Assay unter Verwendung einer seriellen Verdünnung durchführt, um die virale Titer zu bestimmen. Hallo, mein Name ist Dr. Pierre Albo, Direktor des Labors für Neuroimmunologie am AM RIP Institute in Laval, Quebec, Kanada. Heute werden wir demonstrieren, wie man humane Colorevirus-Stämme OT 43 und zwei neun E quantifiziert, die Prototyp-Stämme dieser Viren darstellen und in der Kultur keine Plaques bilden.Daher haben wir einen Assay entwickelt, um dieses Problem zu umgehen. Dieser wird Immunperoxidase-Assay genannt. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, stelle ich Ihnen meine Studentin Gabrielle Marol, meinen Techniker Francis Nader und meine wissenschaftliche Mitarbeiterin Ellan Jacob vor.Beginnen wir also. Zunächst möchten wir unsere Gewebeproben vorbereiten. Wir beginnen damit, die sterilen Röhrchen vorzuwiegen, die wir zur Sammlung jedes Organs verwenden werden.Nachdem wir das Gewicht jedes leeren Röhrchens bestimmt haben, dissezieren wir umgehend die gewünschten Organe unter sterilen Bedingungen und legen sie anschließend auf Eis. Es ist wichtig, die Instrumente zwischen jeder Dissektion mit 70 %igem Ethanol zu spülen. Nachdem wir die Organe gesammelt haben, bestimmen wir das Gewicht jeder biologischen Probe.Anschließend werden wir die Gewebeproben mit 10 % steriler PBS in einer laminarer Luftstromwerkbank mit einem Polytron-Homogenisator homogenisieren. Schalten Sie den Homogenisator ein und heben und senken Sie das Gefäß, um das Gewebe aufzubrechen. Nach der Homogenisierung jeder Probe spülen Sie das Gerät einmal mit steriler Wasser, einmal mit 70 % Ethanol und schließlich mit PBS aus, bevor Sie die nächste Gewebeprobe bearbeiten.Nachdem die Proben homogenisiert wurden, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie das Überstand bei 1000 ×g in neuen sterilen Röhrchen. Zu diesem Zeitpunkt können virale Proben zur Immunperoxidase-Detektion verarbeitet werden.Andernfalls können Sie sie sofort bei minus 80 Grad Celsius einfrieren und lagern, bis Sie bereit für die Assays sind. Als Nächstes möchten wir die Zellproben vorbereiten. Es gibt verschiedene Methoden zur Vorbereitung von anhaftenden und nicht anhaftenden Zellen, bei beiden Methoden werden jedoch intrazelluläre und extrazelluläre Virus-Titer gesammelt.Um die extrazelluläre Virusproduktion in anhaftenden Zellen zu bestimmen, sammeln wir Überstände in sterilen Röhrchen von den infizierten Zellen, die zu geeigneten Zeitpunkten nach der Infektion getestet werden sollen. Zur Abschätzung der intrazellulären Virustiter möchten wir zuerst das Medium entfernen, die Zellen mit warmem und sterilen PBS waschen und dann das gleiche Volumen oder ein bekanntes Volumen Medium hinzufügen sowie drei Zyklen von Gefrieren und Auftauen bei minus 80 Grad Celsius durchführen. Dadurch werden die Zellen lysiert und virale Partikel in das Medium freigesetzt.Für nicht-anklebende Zellen zentrifugieren wir die Zellen zunächst bei tausend ×g fünf Minuten lang. Nachdem die Zellen pelletiert wurden, sammeln wir die Überstände in sterilen Röhrchen. Dies stellt den extrazellulären Anteil des infektiösen Virus dar.Anschließend resuspendieren wir das Zellpellet in dem gleichen Volumen wie dem gesammelten Überstand oder in einem bekannten Volumen Kulturmedium. Nun führen wir drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen bei minus 80 Grad Celsius durch, um die Zellen zu lysieren und virale Partikel in das Medium freizusetzen. Dies stellt den intrazellulären Anteil des infektiösen Virus dar.Nach der Lyse von anhaftenden oder nicht anhaftenden Zellen zentrifugieren Sie diese fünf Minuten bei tausend ×g. Nun kann der Überstand in neuen sterilen Röhrchen gesammelt und die Titer mittels Immunperoxidase-Assay analysiert werden. Alternativ kann die Probe auch sofort bei minus 80 Grad C eingefroren und bis zur Analyse aufbewahrt werden.Um die Produktivität unserer humanen Coronavirus-Infektion in unseren biologischen Proben zu testen, möchten wir einen Immuno-Peroxidase-Assay an Coronavirus-empfänglichen Zellen durchführen. Zunächst wird eine Behandlung mit Trypsin eingesetzt, um eine Suspension empfänglicher Zellen aus einer konfluenten Zellschicht herzustellen. Bei der Arbeit mit humanen Coronaviren werden für humane Coronaviren 229E und OC43 die Zelllinie 293T/17 verwendet, und für das humane Coronavirus OC43 wird die HRT-18-Zelllinie verwendet, nachdem eine Suspension empfänglicher Zellen erzeugt wurde. Diese werden in einer 96-Loch-Platte für die Gewebekultur ausplattiert.Wenn ein Mehrkanalpipettiergerät verwendet wird, je Brunnen hundert Mikroliter Zellsuspension mit der geeigneten Zellkonzentration zugeben. Die Anzahl an empfänglichen Zellen pro Brunnen hängt von der verwendeten Zellart und dem Zeitpunkt der Zellinokulation ab. Nach dem Ausplattieren verweisen wir auf unseren Springer-Protokolltext für detailliertere Informationen.Bevor mit dem Immuno-Peroxidase-Assay begonnen wird, müssen empfängliche Zellen mit den zuvor vorbereiteten Proben infiziert werden. Wenn die empfänglichen Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus jeder 96-Well-Platte, indem Sie die Platte in steriles Papiertuch einwickeln und sie vorsichtig mit der Öffnung nach unten auf ein weiteres Blatt steriles Papier klopfen. Geben Sie danach in jedes Well hundert Mikroliter alpha-MEM, ergänzt mit 1 % FBS.Jede Probe sollte in vier benachbarten Spalten getestet werden. Geben Sie in derselben Platte je Vertiefung je hundert Mikroliter der zu testenden Aliquots in die erste Reihe. Üblicherweise werden empfängliche Zellen mit seriellen logarithmischen Verdünnungen der infizierten Proben beimpft.Führen Sie dies durch, indem Sie erneut 11 Mikroliter pro Vertiefung der gleichen Probe in vier Vertiefungen geben. Mischen Sie nun in der zweiten Reihe der 96-Loch-Platte mit einer Mehrkanalpipette, indem Sie dreimal auf- und abpipettieren, und übertragen Sie jeweils 11 Mikroliter aus jeder Vertiefung in die dritte Reihe und so weiter bis zur letzten Reihe der Platte. Nachdem Sie die Zellen beimpft haben, inkubieren Sie die Platten in einer befeuchteten Kammer bei 33 Grad Celsius mit 5 % CO2 für humanes Coronavirus.2290 infizierte Zellen werden fünf Tage lang für das humane Coronavirus inkubiert und OC43-infizierte Zellen vier Tage lang. Danach können wir mit der Virusdetektion fortfahren.Nach der Inkubation sind wir bereit, das Virus nachzuweisen. Zunächst entfernen wir das Medium vollständig, indem wir die Platten im laminaren Flusswerk auf nicht sterile Papiertücher kippen.Anschließend spülen wir die Zellen vorsichtig, indem wir die Vertiefungen sanft mit PBS auffüllen. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Kippen Sie den PBS aus den Vertiefungen und entfernen Sie restlichen PBS, indem Sie jede Platte in Papiertuch einwickeln.Nachdem die Zellen gewaschen wurden, sollten sie mit 100 % Methanol, das 0,3 % Wasserstoffperoxid enthält, fixiert werden. Geben Sie die Methanol-Mischung zu den Zellen hinzu und lassen Sie die Platte 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach der 30-minütigen Inkubation wird das Fixativ entfernt, indem die Platten über dem Waschbecken ausgeschüttelt werden. Reste des Fixativs werden entfernt, indem die Platten mit der Oberseite nach unten auf mehrere auf der Laborbank liegende Papiertücher ausgeschüttelt werden.Dann lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen, mit der Oberseite nach oben, für etwa 15 bis 30 Minuten, während die Zellen trocknen. Sie können eine auf das Virus spezifische Antikörperlösung in der geeigneten Verdünnung in PBS vorbereiten. Anschließend geben Sie je hundert Mikroliter der spezifischen viralen Antikörperlösung in jede Vertiefung der Inkubationsplatten und inkubieren zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation das Medium vollständig entfernen, indem es über dem Ausguss abgeschüttelt wird. Die Platte spülen, indem die Vertiefungen mit PBS gefüllt werden. Anschließend die Platte in den Ausguss abschütteln und erneut mit PBS spülen.Noch zweimal wiederholen. Entfernen Sie restliches PBS, indem Sie die Platte kopfüber auf nicht sterile Papiertücher auf der Laborfläche abtupfen. Fügen Sie danach hundert Mikroliter Sekundärantikörper in jedes Loch im Verdünnungsverhältnis 1 zu 1000 hinzu.Verdünnung in PBS, die Platte zwei Stunden bei 37 Grad ohne CO2 inkubieren, 30 Minuten vor Ende der Inkubation. Das Detektionsreagenz herstellen, das eine Mischung aus DAB mit PBS und 0,01 % Wasserstoffperoxid ist. Die Platte dreimal wie zuvor in PBS spülen.Nachdem die Platte gewaschen wurde, geben Sie je hundert µL Entwicklungsreagenz in jede Mulde. Inkubieren Sie 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur oder bis die positive Kontrolle angefärbt ist. Um die Reaktion zu stoppen, waschen Sie die Platte einmal mit Wasser, wie zuvor mit PBS, und füllen Sie jede Mulde mit je hundert µL entionisiertem Wasser.Lesen Sie abschließend die Platten mit dem Lichtmikroskop aus, um alle Vertiefungen mit gefärbten Zellen zu quantifizieren. Nun können wir endlich den Titer unseres Virus bestimmen. Dieser kann mithilfe der CAR-Methode berechnet werden, deren Gleichung Sie im Springer-Protokoll finden, das zu diesem Video gehört.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man humane Coronaviren titriert, wenn man dieses Verfahren durchführt. Es ist wichtig zu beachten, dass Sie mit Proben arbeiten, die beide Viren enthalten, und dass Sie unter sterilen Bedingungen arbeiten müssen. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

titration-of-human-coronaviruses-using-an-immunoperoxidase-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Dieses Video zeigt einen Neutralisationsassay, der die Serumwirksamkeit bei der Neutralisierung von SARS-CoV-2-Viren misst. Es handelt sich um pseudotypisierte Viren, Serumverdünnung und lumineszenzbasierte Quantifizierung, die den Neutralisationstiter aufdeckt.

Bewertung funktioneller SARS-CoV-2-neutralisierender Antikörper

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

Dieses Protokoll zeigt einen genauen und objektiven Ansatz zur Visualisierung viraler Titrationen unter Verwendung von Kristallviolett, indem es mit optischer Mikroskopie und immunzytochemischer Färbung verglichen wird.

Verwendung von Crystal Violet zur Verbesserung des visuellen zytopathischen Effekt-basierten Lesens für die virale Titration mit TCID50-Assays

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung eines neuartigen hybriden Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2) als Plattform für die schnelle Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern.

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

Erfahren Sie die Titration von Human Coronaviren mit einem Immunoperoxidase-Assay. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Quantifizierung von Viren ohne zytopathische Effekte für virologische Studien.

Titration von Human Coronaviren Mit einem Immunoperoxidase Assay

Weitere Videos entdecken