Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Die Präparation von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark stellt eine ausgezeichnete Quelle für Antigen-präsentierende Zellen dar, die für in vitro oder in vivo Experimente in der zweistufigen Bildgebung des Immunsystems verwendet werden können. Die Einführung von Antigen-präsentierenden Zellen ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer Zellzellinteraktionen im Kontext des lebenden Lymphknotens. Hier demonstrieren wir die sterile Isolierung von Knochenmark und Kulturtechniken zur Herstellung reifer dendritischer Zellen.

Darüber hinaus verfolgen wir die Entwicklung der dendritischen Zellen vom ersten bis zum 11. Tag. Diese Entwicklung wird mit Standbildern und Inkubator-Videos dargestellt, die mit Hilfe von scent technologies incus site erstellt wurden. Schließlich zeigen wir dendritische Zellen aus dem Knochenmark, die das Cove-Antigen an OT zwei T-Zellen im spiegelnden Lymphknoten präsentieren.

Hallo, ich bin Melanie Matthew im Labor von Micah Halen an der University of California in der Nähe. Haben Sie sich jemals gefragt, was während der Sondierung im Inneren vor sich geht, während Ihre Zellen wachsen? Heute?

Im Rahmen unseres Protokolls zeigen wir Ihnen, wie Sie einige Instrumente vor Ort verwenden können. Mit der tintenfarbenen Stelle können Sie das Wachstum der Zellkulturen in Ihrem Inkubator verfolgen. In diesem Protokoll zeigen wir Ihnen, wie Sie Knochenmarkzellen aus der Maus isolieren und vorbereiten können.

Das erste, was ich Ihnen zeigen werde, ist, Oberschenkelknochen zu entfernen und das Knochenmark zu isolieren. Befeuchten Sie das Tier anschließend mit 70 % Ethanol. Machen Sie Ihren ersten Schnitt entlang der Mittellinie des Tieres.

Schneide dann das Bein nach innen, wie ich es dir hier zeige. Um das Muskelgewebe über dem Oberschenkelknochen freizulegen, solltest du in der Lage sein, den Muskel zur Seite zu ziehen und den großen Oberschenkelknochen mit deiner Präparierpinzette zu greifen. Während du den Knochen mit deiner Präparierpinzette festhältst, bewege dich den Knochen nach unten und mache deinen ersten Schnitt direkt unter dem Gelenk.

Arbeite dann deine Schere über die Länge des Oberschenkelknochens und schneide sie so nah wie möglich am Körper an. Dies kann zu etwas Blut führen, insbesondere wenn Sie die Oberschenkelarterie durchtrennen. Wenn Sie den Oberschenkelknochen entfernen, ist es äußerst wichtig, dass der Knochen intakt bleibt.

Wie Sie hier sehen können, sind die Enden des Knochens nicht geschnitten oder gebrochen worden. Sobald der Oberschenkelknochen entfernt wurde, schneiden Sie das zusätzliche Gewebe ab und legen Sie den Oberschenkelknochen in eine kleine Schale unseres PMI-Mediums. Achten Sie bei der Entnahme von zusätzlichem Gewebe darauf, dass der Oberschenkelknochen nicht austrocknet.

Zu diesem Zeitpunkt sollten die Oberschenkelknochen in eine Schale mit 70 % Ethanol gegeben und fünf bis 10 Minuten lang auf Eis gelegt werden. Für die Zwecke dieses Videos werden wir auf dem Labortisch fortfahren. In dieser Phase des Experiments sollte jedoch alles in eine Gewebekulturhaube überführt werden.

Sobald die Knochen in Ethanol getränkt sind, können Sie sie in eine größere Schale mit sterilem Medium geben, um das Knochenmark zu entfernen. Jetzt sind wir bereit, das Knochenmark zu entfernen und wieder zu suspendieren. Füllen Sie eine Insulinspritze mit sterilem Medium und legen Sie sie zur späteren Verwendung zur Seite.

Fassen Sie den Knochen mit Ihrer sterilen Pinzette. Halten Sie es über einen kleinen Teller für weggeworfene Stücke und schneiden Sie die Epiphyse oder die Enden des Knochens von jeder Seite ab. Platzieren Sie Ihre Insulinspritze in einer Seite des Knochens und spülen Sie das Knochenmark aus dem Knochen in 15 mil Medium.

Wasche den Knochen noch ein oder zwei Mal aus, bis das gesamte Knochenmark ausgespült ist. Sobald das Knochenmark aus dem Knochen gespült wird, ist es fast vollständig weiß. Legen Sie den sauberen Knochen in die Ablageschale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Oberschenkelknochen.

Sobald dies abgeschlossen ist, brechen Sie vorsichtig alle Markstücke, die durch den Waschprozess nicht auseinandergebrochen wurden, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Dies dauert fünf bis 10 Minuten Pipettieren. Eine einzellige Suspension in ein konisches 50-mil-Röhrchen geben, die Platte mindestens dreimal mit 10 mil Medium waschen.

Schleudern Sie jedes Mal die Zellen herunter, entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie mit den Fingern fest und zügig über den Boden des Röhrchens streichen. Um die roten Blutkörperchen oder Erythrozyten zu entfernen, führen wir eine Wasserlyse durch. Eine weitere Methode zur Entfernung roter Blutkörperchen ist die Ammoniumchlorid-Lyse.

Beide Methoden wurden bereits in früheren JoVE-Videoartikeln beschrieben. Isolierung von CD 4-positiven T-Zellen aus Mauslymphknoten mit der Milan max-Reinigung JoVE Ausgabe neun und die Präparation des T-Zell-Wachstumsfaktors aus Rattenzyten JoVE. Ausgabe 10.

Nach der Entfernung Ihrer Erythrozyten sind Sie nun bereit, sich selbst zu kultivieren. Bevor ich dich also durch die Dendri-Zellkultur führe, möchte ich dir die Incus-Stelle vorstellen. Die Incus-Stelle ermöglicht die Subtraktion des prognostizierten Zellkulturwachstums innerhalb des Inkubators, so dass wir uns selbst beobachten können, wie sie sich verhalten oder schlecht verhalten.

Sobald eine Kultur eingerichtet ist, legen Sie sie in das Tablett mit der entsprechenden Größe und schieben Sie die Incus-Stelle zu. Dann stellen Sie auf Ihrem Computer einfach das Zeitintervall ein und wählen dann die Vertiefungen aus, die Sie abbilden möchten, und lassen Sie die tintige Website Daten für Sie sammeln. Die Filme zeigen Ihnen in diesem Protokoll, wie sich die Morphologie der dendritischen Zellen in vitro verändert

Diese Videos wurden direkt aus dem Incus-Site-Programm exportiert. Da sich die dendritischen Zellen vom ersten bis zum 11. Tag entwickeln, können Sie eine echte morphologische Veränderung sehen, wenn sie sich vergrößern und den dendritischen Zellphänotyp annehmen. Nach dem Lyse der Erythrozyten und deren Entfernung werden die Zellen in primären dendritischen Zellmedien gewaschen und mit 5 Millionen pro mille plattiert.

Diese Zellen sollten zunächst in primären dendritischen Zellkulturmedien kultiviert werden, und später kultivieren wir sie in sekundären DC-Medien, die mit 40 Nanogramm pro mil IL vier und hundert Nanogramm pro mil TNF alpha ergänzt werden. Diese Zytokine helfen bei der Entwicklung reifer dendritischer Zellen, die von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen ähneln. Jetzt zeige ich Ihnen, wie die Kulturen aussehen, während sie sich entwickeln und wie Sie sie im Laufe der Zeit erhalten können.

Sobald Sie die Zellen plattiert haben, können Sie die dendritischen Zellen 72 Stunden lang kultivieren, bevor Sie das erste Medium wechseln. So sieht eine typische Kultur aus, kurz nachdem Sie die Zellen am ersten Tag plattiert haben. Und hier ist ein Blick auf die Zellen.

Am dritten Tag können Sie sehen, dass die Zellen begonnen haben, an der Platte zu haften, aber nicht den klassischen dendritischen Zellphänotyp angenommen haben. Entfernen Sie am vierten Tag die Medien und fügen Sie 10 Mils frischer primärer DC-Medienaspiration der Medien hinzu. Am vierten Tag entfernen wir Lymphozyten in allen anderen nicht adhärenten Zellen.

Jetzt können Sie sich für weitere drei Tage, sieben Tage nach Ihrer ersten Beschichtung, wieder in den Inkubator legen. So sieht Ihre typische Kultur aus. Sie können erkennen, dass es an der Zeit ist, die Zellen zu teilen und abzustoßen.

Am siebten Tag werden die dendritischen Zellen von der Platte entfernt, indem das Medium aspiriert und dann 300 Millimolare sterile EDTA hinzugefügt und fünf Minuten lang inkubiert wird. Dann wird die Platte wiederholt gespült, indem die EDTA-Lösung in einem 45-Grad-Winkel gehalten und gegen die Rückseite der Platte pipettiert wird. Dies geschieht mehrere Minuten lang, um sicherzustellen, dass Sie alle anhaftenden dendritischen Zellen entfernen.

Die Zellen werden in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt und zweimal mit sekundären Gleichstrommedien gewaschen. Die Zellen werden dann resuspendiert und mit 5 Millionen Zellen pro Platte plattiert. Frisch beschichtete dendritische Zellen am siebten Tag siedeln sich schnell am Boden der Platte ab, verkleben und beginnen sich auszubreiten.

Wie Sie hier im Video der Zichy-Site sehen können, wurde dieses Video im Laufe von zwei Tagen im Inkubator aufgenommen, um Ihnen die Entwicklung der dendritischen Zellen von der ersten Neubeschichtung am siebten Tag bis zum frühen neunten Tag zu zeigen. Morphologie Dendritische Zellen können im Antigenpuls aktiviert werden, indem zwei Mikrogramm pro LLPS hinzugefügt werden, hier mit hundert Mikrogramm für Eizellen zur Verwendung mit T-Zellen, die von OT gereinigt wurden, zwei Mäuse, die Eizellen spezifisch CD vier positive T-Zellen haben. Wenn Sie ein anderes Antigen verwenden, ist es wichtig sicherzustellen, dass Sie eine optimale Antigenkonzentration verwenden, um Ihre DCS hier zu pulsieren, die OV und LPS werden den Primärmedien so zugesetzt, dass die endgültige Konzentration von LPS zwei Mikrogramm pro mil in 20 mil und die Eizellen hundert Mikrogramm pro mil in 20 mil betragen.

Hier ist ein Foto, das zeigt, wie eine typische Day-10-Kultur von dendritischen Zellen aussieht. Auf diesem Foto können Sie sehen, dass die Morphologie sehr typisch für eine Antigen-präsentierende Zelle ist. Sie sollten den prozentualen Anteil der CD 11 C positiven dendritischen Zellen immer per Fax überprüfen.

Damit stellen Sie sicher, dass Sie eine relativ reine Kultur dendritischer Zellen für Ihre Experimente haben. Hier verwenden wir die tintenfarbene Stelle von SEN-Instrumenten, um die Aktivierung von dendritischen Zellen zu überwachen, die am Tag 10 mit LPS in einem Antigen-Puls behandelt wurden. Dieses Video erstreckt sich über einen Zeitraum von 24 Stunden unmittelbar nach der Zugabe von LPS und dem Val und Peptid, und darin werden dendritische Zellen aktiver und es gibt einige offensichtliche morphologische Veränderungen.

Sobald Ihre dendritischen Zellen im Antigenpuls aktiviert wurden, können Sie sie durch Inkubation mit 300 Millimolar EDTA und Waschen der Platte wieder sammeln. Schleudern Sie nun Ihre Zellen herunter, waschen Sie sie zweimal mit 50 mil RPMI-Medien, um zusätzliches Antigen zu entfernen, und markieren Sie sie mit dem entsprechenden Zelltracker-Farbstoff. In diesem Experiment werde ich die Zellen im Leistenlymphknoten abbilden.

Wir werden zwei bis 5 Millionen dendritische Zellen in die Flankenregion der hier gezeigten Maus dermal injizieren müssen. Wir lassen dann 24 Stunden Zeit, bis die dendritischen Zellen zum Trainingslymphknoten gelangen. Hier in diesem Video werden dendritische Zellen mit CMF zwei hc, einem blauen Zell-Tracker-Farbstoff, markiert.

Sie können sehen, wie die dendritischen Zellen mit markierten T-Zellen interagieren, die antigenspezifisch für Volin sind. Diese T-Zellen sind mit ccf SE markiert. Sie können auch C-M-T-M-R oder einen der anderen Zell-Tracker-Farbstoffe für molekulare Sonden verwenden. Dies ist das frühe Aktivierungsstadium von T-Zellen, die mit dcs interagieren.

Da sie antigenspezifisch sind, können Sie sehen, dass die T-Zellen an den Ranken der blau markierten dcs kleben. Damit ist unser Protokoll abgeschlossen, das die Präparation und Verwendung von dendritischen Knochenmarkzellen aus der Maus in einem Experiment mit zwei Schichten zeigt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.