Name: Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung und Passage humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) auf Matrigel in feeder-freien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der Pluripotenz für weiterführende Experimente.

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Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.

Splitting hESCs von Matrigel auf Matrigel Normalerweise wird eine konfluente 6-Well-Platte von hESCs auf Matrigel können split von 1.03 Uhr bis 01.05 Uhr zu einem anderen Matrigel Platte werden, mit dem Brunnen zu konfluenten wieder 4-5 Tage nach der Trennung. <ol><li> CM und Matrigel Platten werden wie oben beschrieben vor der Spaltung. </li><li> Am Tag der Aufspaltung, waschen jede Vertiefung für die Spaltung mit 1 x PBS, pH 7,4, 1ml von 1mg/ml Dispase (verdünnte 5mg/ml Stammlösung mit DMEM/F12 Medien) in jede Vertiefung, und bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Wash jedes Well dreimal mit 1 × PBS, pH 7,4, 1ml von ES Medien ohne bFGF, verwenden Sie einen Zellschaber Kolonien aus dem Boden des Brunnens zu kratzen, sammeln die suspendierten hESCs in einem 50ml Falcon-Röhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 200g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zum erneuten Platte der hESCs auf Matrigel Platten ersten Waschen die Matrigel-Platten mit DMEM/F12 und fügen 2,5 ml CM mit 10ng/ml bFGF pro Vertiefung ergänzt. Resuspendieren hESC Pellet in einem geeigneten Volumen von CM mit 10ng/ml bFGF, Pipette die Zellsuspension nach oben und unten drei Mal ergänzt. (Hinweis: Wenn hESCs zur Aufspaltung von Matrigel Platten kommen, sind die Klumpen sehr leicht zu brechen, deshalb drei Runden Pipettieren ist genug und mehr Pipettieren kann over-stören den Kolonien und Einzel-Zellen.) Aliquot von 0,5 ml hESC Klumpen Suspension pro auch der 6-well Matrigel Platte 3ml pro Vertiefung zu erreichen, wie ein Endvolumen. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator. </li></ol> Nachweis der Pluripotenz Marker durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie Immunfluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um die Expression von humanen embryonalen Stammzellen Pluripotenz Marker Oct-4 und SSEA-4 während der Kultivierung zu untersuchen. <ol><li> Saugen Sie Medien aus einer gut und waschen mit 1 x PBS, pH 7,4. Add 2 ml 3,7% Formaldehyd zum Brunnen, um für 10 Minuten zu beheben. </li><li> Spülen Sie mit 1xPBS, pH 7,4, fügen 2ml Methanol zum Brunnen und bei -20 ° C für 2 min. </li><li> Spülen Sie mit 1xPBS, pH 7,4, und Block mit 1 ml 0,2% Rinder serume Albumin (BSA) für 5 min. </li><li> 1ml von Oct-4 oder anti-h/mSSEA-4 Antikörper (1:200 Verdünnung in 0,2% BSA) und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht. (Hinweis: für SSEA-4-Färbung, gehen Sie direkt zu Schritt 6) </li><li> Spülen Sie dreimal mit 1xPBS, pH 7,4, fügen FITC-konjugierten Kaninchen-IgG (1:500 Verdünnung in 0,2% BSA) und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Spülen Sie 3-mal mit 1xPBS, pH 7,4, und geben Sie einen Tropfen der Montage-Lösung (kann DAPI enthalten, wenn nukleare Visualisierung gewünscht wird) in der Mitte des Brunnens. Put Deckglas oben auf die Zellen, das Siegel mit Nagellack und evaluieren durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. </li></ol> Menschliche embryonale Stammzellen Einnahmen ES Medien (embryonale Stammzell-Medien): DMEM/F12 - 400ml Knockout Serum Replacer - 100ml Non-Essential Amino Acids - 5ml 200 mM Glutamax / BME-Lösung - 5ml Penicillin / Streptomycin - 5ml Gut durchmischen und endgültige hESC Nährmedien in 500ml-Flaschen bei 4 ° C. Gut für maximal zwei Wochen. MEF Culture Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Non-Essential Amino Acids - 10ml Glutamin - 10ml Penicllin / Streptomycin - 10ml Gut durchmischen und endgültige MEF Nährmedien bei 4 ° C. 200 mM Glutamax / BME-Lösung: Glutamax - 100ml β-Mercaptoethanol (Stock-Lösung bei 14,3 Mio.) - 140 μ1 Mix beiden Lösungen gut und dann aliquoten 10ml Portionen. Keep Aliquots bei -20 ° C. bFGF-Lösung (Endkonzentration Lager: 10 Mikrogramm / ml): bFGF (FGF2) - 50 ug 0,1% BSA in 1xPBS, pH 7,4 - 5ml Lösen Sie 50 Mikrogramm bFGF in 5ml 0,1% BSA auf eine 10 ug / ml Aktie zu machen. Aliquot in 500 ul Portionen. Lagerung bei -80 ° C. Collagenase IV-Lösung (1mg/ml): Collagenase IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Fügen Sie die Kollagenase IV Pulver zu einer 50ml Falcon-Röhrchen. In der Motorhaube, in 50 ml sterile DMEM/F12 Media-Mix. Vortex die Lösung für &lt;1 min. um sicherzustellen, dass das Pulver aufgelöst ist. In der Motorhaube, durch ein 0,22 um-Filter in eine neue sterile 50ml Falcon-Röhrchen passieren. Diese Lösung ist gut für maximal 2 Wochen bei 4 ° C gelagert Dispase-Lösung (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 Media - 8ml Aliquot kommerziellen 5mg/ml Dispase-Lösung und bei -20 ° C. Verdünnen Dispase zu 1mg/ml mit DMEM/F12. Diese Lösung kann für 1 Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Diese Serie von 3 Videos demonstriert, wie humanen embryonalen Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten wachsen (MEF) Feeder-Zellen (Video 1), wie die Passage ihnen Feeder zellfreien Platten (Video 2) Matrigel, und wie halten hESCs durch Passagieren in Matrigel Feeder zellfreien Bedingungen (Video 3). Zahlreiche frühere Studien zeigten, dass die Wartung von lebensfähigen, undifferenzierte hES erfordert Kultur auf inaktivierten MEF Feeder-Zellen. Doch für viele Experimente, ist eine reine Population von hESCs frei von Feeder-Zellen...

<table><tbody><tr><td>Knockout-Serumersatz (KSR)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagenz</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagenz</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagenz</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4-Antikörper</td><td>Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyco&amp;#8211;erythrin-konjugiertes Maus-IgG3</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Antikaninchen-IgG</td><td>Reagenz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

von mefs auf matrigel 3: die passage hescs von matrigel auf matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

Dieses Video demonstriert, wie das Wachstum von menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) unter feederzellfreien Bedingungen aufrechterhalten und wie diese kontinuierlich passagiert werden ...

Um humane embryonale Stammzellen, die auf Matrigel gezüchtet wurden, zu teilen, verwenden wir zwei Matrigel-Platten. Wir beginnen mit einer konfluenten sechswelligen Platte embryonaler Stammzellen auf Matrigel, die im Verhältnis eins zu drei bis eins zu fünf auf eine andere Matrigel-Platte aufgeteilt werden können. Dadurch erreichen die Zellen in den neuen Wells erneut Konfluenz, vier bis fünf Tage nach der Teilung, am Tag der Teilung.Waschen Sie jede Vertiefung, die geteilt werden soll, mit einem Mal PBS pH 7,4. Anschließend geben Sie je ein Milliliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Dis-Paste in jede Vertiefung und inkubieren drei Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit einem Mal PBS pH 7,4.Fügen Sie dann ein Milliliter embryonaler Stammzell-Medien ohne BF GF hinzu und verwenden Sie einen Zellabstreifer, um die Kolonien vom Boden der Vertiefung abzulösen. Sammeln Sie die resuspendierten embryonalen Stammzellen in einem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation bei 200 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Um die humanen embryonalen Stammzellen auf Matrigel-Platten erneut auszuplatzieren, waschen Sie zunächst die Matrigel-Platten mit D-M-E-M-F 12 und geben Sie 2,5 Milliliter Meth-Bedingungsmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter, hinzu.BFGF pro Brunnen, nachdem die Zellen zentrifugiert wurden, resuspendieren Sie das Pellet aus menschlichen aurikulären Stammzellen in einem geeigneten Volumen der Meth-Bedingung. Medium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter BFGF, die Zellsuspension dreimal auf und ab pipettieren.Beachten Sie, dass sich die Stammzellklumpen aus Matrigel leicht auflösen. Daher sollte das Pipettieren dreimal ausreichen, um die Klumpen aufzubrechen, ohne dass die Kolonien zu klein werden. Abschließend aliquotieren Sie 0,5 Milliliter der humanen Amry-Stammzellsuspension pro Vertiefung, um drei Mio. pro Vertiefung zu erreichen.Stellen Sie als endgültiges Volumen sicher, dass die Zellklumpen gleichmäßig verteilt sind, und stellen Sie die Platte dann in einen 37-Grad-Inkubator. Abhängig von der speziellen amry Stammzelllinie werden amry Stammzellen vier bis fünf Tage nach der Teilung erneut konfluent. Wenn die Kolonien beginnen, sich zu berühren, ist es wichtig zu wissen, ob Ihre humanen amry Stammzellen die Pluripotenz oder Stammzelleigenschaften in der Kultur beibehalten oder nicht.Um die Pluripotenz der Zellen während der Kultivierung von embryonalen Stammzellen zu überprüfen, verwenden wir die Immunfluoreszenzmikroskopie, um die Expression der Pluripotenzmarker OCT4 und SSEA4 in einem der Wells zu untersuchen. Unsere 6-Well-Platte wird fixiert und für OCT4 und SSEA4 gefärbt. Wenn wir beobachten, dass die Zellen für beide Marker fluoreszenzmarkiert sind, wissen wir, dass unsere humanen embryonalen Stammzellen die Pluripotenz beibehalten haben und für unsere Experimente verwendet werden können.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man humane embryonale Stammzellen unter Einsatz potenter Methoden kultiviert und erhält, zusammen mit embryonalen Fibroblasten, Fütterungszellen und unter feldfreien Bedingungen auf Metro-Job. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung...

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte...

Schnelle, kostengünstige, enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen auf Feederzellen durch Ethylendiamintetraessigsäure-vermittelte Disadhäsion

Lernen Sie die Kultivierung und Passage humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) auf Matrigel in feeder-freien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der Pluripotenz für weiterführende Experimente.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

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