Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Hallo, ich bin Melanie Matthew. Ich bin Doktorandin im Labor von Micah Hollins an der University of California Irvine im Fachbereich Physiologie und Biophysik. Und heute werden wir gemeinsam mit Dr. Christine Beaton zeigen, wie wir die reagierende Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellpopulation im Rattenohr abbilden.

Dr. Christine Beaton wird zuerst eine verzögerte Hypersensitivitätsreaktion (DTH) im Rattenohr auslösen. Anschließend werden wir zur in-situ-Bildgebung des Rattenohrs mittels Zweiphotonenmikroskopie übergehen. Vor zwei Tagen habe ich GFP-markierte, albuminspezifische T-Zellen in eine Lewis-Ratte injiziert.

Und heute werde ich dieselbe Ratte am Ohr herausfordern. Im rechten Ohr werde ich Albumin injizieren. Und im linken Ohr werde ich lediglich etwas PBS injizieren.

Die Dosis an Albumin, die ich injiziere, beträgt 20 Mikrogramm in 20 Mikroliter. Das verwendete Albumin ist eine 1:1-Mischung aus mit Texas Red markiertem und unmarkiertem Albumin. Dies ist die Aufnahme, auf der ich Ihnen zeigen werde, wie ich die Injektion durchführe.

Ich habe also meine linke Hand, ich bin Rechtshänder. An meiner linken Hand habe ich den Handschuh abgenommen, um einen Finger unter das Ohr und den anderen darüber legen zu können, um die Haut zu straffen, sodass ich genau sehen kann, wo sich die Nadel befindet, und zwischen die beiden Hautschichten in die Luft eindringen kann, die sehr dünn ist. Dafür verwende ich 27-Gauge-Nadeln, um etwas äußerst Dünnes zu haben, das dort eindringen kann.

Wenn ich es also umdrehe, sehen Sie deutlich, wo der Texas-rot-Farbstoff und wo das PBS hingegangen sind. Wir befinden uns nun 42 Stunden nach der Herausforderung, und ich werde einen federbelasteten Messschraubstock verwenden, um die Dicke des Ohrs zu messen. Ich messe beide Ohren, das rechte Ohr, das mit dem Albumin herausgefordert wurde, und das linke Ohr, das nicht herausgefordert wurde. Der Unterschied in der Dicke gibt uns Aufschluss über die Intensität der Entzündung.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 oder 58 oder 57 oder 57. Und das andere Ohr 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hallo. Also Christine Beaton hat uns gerade die Ratte gegeben, die sie nach der Messung der DTH-Reaktion entfernt hat.

Wir haben sie auf Eis hierher transportiert. Dies ist das linke Ohr der Ratte. Und nun befinden wir uns im Labor von Ian Parker, wo wir Zwei-Photonen-Mikroskopie durchführen.

Ich werde diese Ohren für die In-situ-Zweiphotonen-Bildgebung vorbereiten. Dazu bereite ich eines der Rattenohren an der Ohrbasis vor. Das Gewebe ist hier deutlich dicker, und es ragen einige Haare nach oben, was etwas unübersichtlich wird, wenn ich einfach direkt hineinschneide.

Als Erstes werde ich etwas von dem Haar abschneiden. Ich halte das Ohr vorsichtig fest. Mein Finger erleichtert es erheblich, das Gewebe zu kontrollieren, wenn man es zwischen Daumen und Zeigefinger hält.

Ich bevorzuge es gegenüber der Verwendung von Pinzetten, weil ich mit Pinzetten einfach nicht so gut spüren kann, was das Gewebe tut, und wir machen uns stets Sorgen, das Gewebe zu beschädigen. Daher möchten wir spüren können, was wir damit tun. Deshalb bevorzuge ich die Verwendung meiner Finger.

Dies ist die Hautschicht, die sich hier am Rattenohr ablöst. Während ich etwas von dem Haar abschnitt, konnte ich vorsichtig etwas von der Dermis entfernen, die einfach so leicht abblättert. Dazu verwendet man sehr kleine Präzisionsscheren, am besten leicht gekrümmte Scheren.

Sie sollten das Gewebe nicht durchstechen, sondern vorsichtig von der Basis des Ohres bis zur Spitze vorgehen und dabei sanft einige Schichten der Dermis entfernen. Für die Bildgebung benötigen wir kein sehr großes Fenster. Dieser Bereich hier ist bereits ausreichend, um einige ansprechende Aufnahmen der in das Gewebe eindringenden Zellen zu erhalten.

Sie können sehen, dass hier am Ansatz des Ohrs noch einige intakte Blutgefäße vorhanden sind, die fast bis zur Ohrspitze reichen. Dieser gesamte Bereich eignet sich hervorragend zur Abbildung der DTH. Daher werde ich nun das freigelegte Gewebestück herausschneiden, um ein kleines Gewebestück zu erhalten, das wir auf unserer Abbildungsplattform verkleben können.

Schneiden Sie hier einfach ein, drehen Sie es um. Ich kann hier schneiden. Wir haben ein kleines Stück Gewebe, das wir für die Bildgebung an unserem Zwei-Photonen-Mikroskop vorbereiten können.

Dies sind unzerbrechliche Kunststoff-Abdeckungen, die wir auf die Größe unseres Gewebes zuschneiden. Anschließend montieren wir das Gewebe mithilfe des Bet-Bindemittels darauf. Danach befestigen wir diese unzerbrechlichen Kunststoff-Abdeckungen mit Silikonfett an unserer In-situ-Bildgebungsplattform.

Ich nehme dieses kleine Stück Luftgewebe, das eine leichte Krümmung aufweist, daher muss ich es beim Ankleben etwas glätten. Nicht ideal, aber es wird funktionieren. Sie nehmen also ein solches Deckglas und schneiden es zu, schätzen die Größe Ihres Ohrs ab und schneiden es etwas größer, als Sie denken, dass es benötigt wird.

Um unser Gewebe auf den Deckgläsern zu befestigen, verwenden wir einen gewebesicheren Sekundenkleber namens Bet Long. Wir beziehen ihn von 3M und geben einfach ein paar Tropfen davon auf unser Deckglas.

Ich möchte nicht zu viel nehmen. Außerdem sollten Sie darauf achten, dass der Kleber gleichmäßig verteilt wird. Daher nehme ich jetzt ein kleines Stück Linsenpapier und verwende die Ecke, um den Kleber mit der Ecke hier über die Deckglasfläche zu verteilen.

Es wird etwas nach oben gehen aufgrund des zusätzlichen Klebers, und sobald dieser Kleber mit Wasser in Berührung kommt, härtet er aus. Seien Sie also sehr vorsichtig mit Ihrer Gewebeprobe. Ich werde daher die Ecke des Gewebes hier greifen, die wir vermutlich nicht abbilden werden, da sie sich im gekrümmten Bereich befindet.

Ich werde es etwas abtrocknen, und zwar die Unterseite auf dem Linsenpapier, damit alles gut getrocknet ist. Dann werde ich mit der Ecke davon, dem Rattenohrgewebe, die Deckglasplatte berühren.

Und es sollte sich unmittelbar dort heilen, wo ich es berührt habe. Den Rest werde ich einfach leicht glätten, indem ich vorsichtig auf die Ränder drücke. So hoffentlich erhalten wir ein gutes Bildfeld.

Jetzt werde ich den Klebstoff durch Eintauchen in Medium aushärten lassen. Um zu verhindern, dass der Klebstoff auf das Gewebe gelangt, drehen wir es um und tauchen langsam zuerst eine Ecke in unser Mediumreservoir ein. Es sollte dann gut befestigt sein, sodass wir es in unserer Gewebe-Bildgebungskammer abbilden können. Nun werden wir das vorbereitete Gewebestück, das für die In-situ-Bildgebung geeignet ist, nämlich das Stück Bierhefe-Gewebe, auf dem Objektträger befestigen.

Hier ist unser Gewebestück mit dem Silikonfett an der Unterseite, das wir vorsichtig in den Mediumfluss legen. Nun ist es durch das Silikonfett am Boden der Messstelle befestigt. Erhöhen Sie den Mediumfluss und platzieren Sie unsere Temperatursonde direkt daneben.

Und jetzt werden wir fokussieren. Ich schalte nun unsere Fokussierleuchte ein, unser helles Licht. Ich nehme nun unser 20x-Objektiv und senke es in die Kammer ab.

Stellen Sie sicher, dass es das Gewebe nicht berührt. Schauen Sie durch das Okular und fokussieren Sie das Ohr-Gewebe. Und da ist es.

Hier sehen Sie autofluoreszierende grüne Haarfollikel in der dermalen Schicht des Rattenohrs. Umgeben sind diese Haarfollikel von einer dichten Kollagenschicht. Diese Schicht entfernen wir für die T-Photonen-Bildgebung der T-Gedächtniszellen.

Die autofluoreszierenden Haarfollikel werden das Bild genauso überlagern wie das helle Kollagen der oberen Dermischicht. Hier sehen Sie also, dass wir APZs haben, die Volin konjugiert mit Texas Red aufgenommen haben, und diese sind entlang dieser blauen Kollagenfasern eingebettet. Die Kollagenfasern erscheinen blau aufgrund der zweiten harmonischen Generierung, die bei der Photonabbildung entlang der Kollagenfasern auftritt.

Wir haben hochbewegliche T-Zellen. Diese bewegen sich entlang der Kollagenfasern auf und ab und interagieren mit den antigenpräsentierenden Zellen (APCs). In diesem Video sahen Sie, wie Dr. Christine Beaton eine adoptive DTH-Reaktion in der Lewis-Ratte induzierte.

Dann haben wir Ihnen unsere Vorbereitung des Ohrs zur Bildgebung gezeigt, die reaktiven T-Effektor-Gedächtniszellen sowie das Rattenohr und unsere Zwei-Photonen-Techniken dazu.