Name: Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Induktion von DTH im Rattenohr und die Zweiphotonen-Mikroskopie zur Visualisierung von Effektor- und Memory-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die in-situ-Analyse immunologischer Reaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Induktion von Adoptive DTH Bitte beachten Sie JoVE Artikel: <a href="/index/Details.stp?ID=325">Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten</a> Christine Beeton, George K. Chandy Institut für Physiologie und Biophysik, University of California, Irvine J. Visualisierte Experimente, Issue 8 Hier haben wir dieses Protokoll mit Antigen (Ovalbumin), konjugiert mit Texas-Red in einem Verhältnis von 1:1 mit unmarkiertem Antigen um zur Visualisierung von Phagozyten Antigen-präsentierenden Zellen können modifiziert werden. Ohrgewebe Ernte <ol><li> Euthanize der Ratte in der gewünschten Zeit-Punkt durch Verfahren in Ihrem genehmigten Tier-Protokoll beschrieben. Hier verwenden wir eine Überdosis des Narkosemittels, Isofluran. Dies ist in einem geschlossenen Behälter in einem gut belüfteten Motorhaube getan. Stellen Sie sicher, das Tier tot ist entweder durch Enthauptung durch die Eröffnung der Brusthöhle und Schneiden des Herzens. </li><li> Mit großen Schere entfernen das Ohr mit einem einzigen Schnitt, möglichst nahe an den Körper des Tieres wie möglich (Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg"> Abbildung 1. Die Entfernung der Ratte Ohr </li><li> Legen Sie das Ohr in einer 15 ml konische Röhrchen mit ca. 10 ml eiskaltem 1x PBS oder RPMI-1640. Halten Sie die Gewebeproben auf Eis, bis Sie bereit, um das Gewebe für die Bildgebung herzustellen sind. </li><li> Bild des Gewebes so schnell wie möglich, wir finden aber, dass 1 bis 2 Stunden auf Eis keine erkennbare Wirkung auf die Zellbewegung in das Gewebe, wenn das Gewebe geerntet und abgebildet sofort verglichen. </li></ol> Tissue Vorbereitung für Imaging I. Entfernung von epidermalen und dermalen Schicht * Hinweis: Die tiefe Hautschicht muss beibehalten werden. Wenn es richtig gemacht großen Blutgefäße bleiben erhalten und der Knorpel des Ohres nicht ausgesetzt werden. Dies ist eine schwierige Technik, vor allem, wenn es keine Entzündung (Kontrollbedingungen) und es ist hilfreich, ein Binokular verwenden. <ol><li> Legen Sie beide das Gewebe und Medien aus dem konischen Rohr in einer 10 cm Gewebe Kulturschale. </li><li> Mit behandschuhten Händen halten die Ratte Ohr sanft an der Spitze des Ohres (distalen) mit der Dorsalseite des Ohres nach oben (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg"> Abbildung 2. Trim Fell aus dem Ohr </li><li> Mit dem Daumen auf der Oberseite des Ohrs, steady das Gewebe während der Verwendung der Spitze des geschlossenen Dumont Nr. 5 Schere, um die Dermis aus der tiefen Dermis zu trennen. Alternativ, wenn der Rand des Ohres hat einen Überhang von Haut / tiefe Dermis, kann dies mit einer Pinzette fassen und vorsichtig herausgezogen, um diese aus dem Gewebe darunter (Abbildung 3) zu trennen. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg"> Abbildung 3. Die Entfernung der oberen Dermis </li><li> Nach einem kleinen Bereich der Haut hat sich von dem darunter liegenden Gewebe abgetrennt wurde, wiederholen Sie die Schritte Trennung alternativ mit einer Schere zu schneiden zwischen den Hautschichten und Pinzette vorsichtig entfernen und Abziehen der Haut abgelöst. </li><li> Expose eine 5 x 5 mm oder größere Fläche Ohrgewebe, dass mindestens 3 mm von der ersten Seite der Antigen-Injektion (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg"> Abbildung 4. Tissue für die Bildgebung ausgesetzt </li></ol> II. Sicherung Tissue Imaging zur Bühne <ol><li> Schneiden Sie ein Kunststoff Deckglas zu einer Größe etwas größer als vorbereitet Gewebe. </li><li> Verteilen Sie eine dünne Schicht von 3M Vetbond ™ Gewebe-safe Kleber auf den Objektträger. </li><li> Fassen Sie die Ecke der präparierten Gewebe (wo Sie sind nicht geeignet, Bild), von Medien zu entfernen, und tupfen Sie die Unterseite des Gewebes auf der Linse Papier oder Kym wischen, um überschüssige Medien zu entfernen. </li><li> Tippen Sie auf die Kante des Gewebes auf den Leim bedeckt Schlitten (die Vetbond härtet sofort auf nassen Gewebe). Vorsichtig dehnen das Gewebe flach, mit dem anderen Ende ist der letzte, der die Folie berühren (Abbildung 5) <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg"> Abbildung 5. Berg Gewebe Slip Cover </li><li> Cure den Vetbond ™ durch Umkehrung der Gewebeprobe / Rutsche und Eintauchen in ein Reservoir von Medien, so dass das Gewebe und ziehen nach unten und rund sind in einem Winkel von 45 Grad. Halten Sie das Gewebe auf den Kopf in einem Winkel hilft, überschüssigen Kleber aus Aushärtung an der exponierten Gewebeoberfläche verhindern. Kleber auf der Oberfläche des Gewebes blockiert den Laser (Abbildung 6). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg"> Abbildung 6. Cure vetbond Gewebe glue durch Eintauchen in den Medien Hinweis: Die Schritte 2-5 können ein wenig Übung zu meistern. Versuchen Sie üben mit weggeworfenen oder extra Gewebestücke, bevor zum ersten Mal. </li><li> Dab eine kleine Menge Silikonfett auf den unteren Rand der Folie. </li><li> Legen Sie die Folie in der Perfusionskammer. Stellen Sie sicher, dass die Perfusion Medien ist fließend, 37 ° C und mit Sauerstoff versorgt, bevor Sie Gewebe. Drücken Sie vorsichtig auf die Ränder der Folie machen ein Siegel mit dem Silikonfett zwischen der Unterseite des Perfusionskammer und die Kunststoff-Deckglas. </li></ol> III. Zwei-Photonen-Imaging <ol><li> Mit Hellfeld-Durchlicht, auf der Oberseite des Gewebes zu konzentrieren. Schalten Sie alle Lichter. </li><li> Schalten Sie den Laser, PMTs wie von Ihrem Multi-Photonen-Mikroskop-System erforderlich. </li><li> Second Harmonic Generation (SHG) in hoch geordneten faserige Proteine ​​(Kollagen und Myosin) erzeugt ein Signal mit der halben Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lasers. Wir verwenden Anregung bei 900 nm, was zu SHG bei 450 nm, die visualisiert werden können mit dem "blue"-Kanal des Mikroskops. SHG-Generation ist eine nicht-lineare (Zwei-Photonen-) Prozess, und bietet somit eine optische "Schneiden"-Effekt ähnlich dem der Zwei-Photonen-Anregung der Fluoreszenz. Die maximale Effizienz des SHG tritt auf, wenn die Fibrillen senkrecht zur Laser, während Fibrillen, die parallel ausgeführt werden nicht visualisiert. 1 </li><li> Suchen Sie einen guten Imaging-Bereich mit reichlich Zellen, stellen Sie Ihren Erwerb Bereich, so dass die Mehrzahl der Zellen in der Mitte sind und beginnen Bildgebung. Hinweis: In DTH-Reaktionen, T-Zellen und anderen Zellen infiltriert sind oft zusammen konzentriert werden, während andere Bereiche frei von infiltrierenden Zellen 2 sind. Daher kann es einige Zeit dauern, die Suche im Gewebe um die beste Gegend, um Bild zu finden. </li><li> Prüfen Sie, ob die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Beurteilung Zelle Geschwindigkeit und Polarität während der Bildgebung. Verwenden Sie die niedrigste Laserleistung, dass akzeptable Bildqualität bietet, um minimal Foto-Schäden zu gewährleisten. </li><li> Swap in eine neue Gewebe Vorbereitung wie nötig. </li></ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

imaging effektor-memory-t-zellen im ohr nach induktion der adoptive dth

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine Immun-Reaktion, bei der die wichtigsten Akteure sind CCR7 - Effektor / Memory T-Lymphozyten. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer DTH-Reaktion bei der Ratte Ohr. Effektor / Memory T-Zell-Antwort - Dies ist eine Demonstration der Zubereitung von Ratten Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der CCR7 gefolgt. Effektor / Memory T-Zell-Linie (Beeton, C J. Visualisierte Experimente, Issue 8) - Ein Adoptiv-DTH wird durch die intraperitoneale Injektion von GFP-markierten Ova-spezifische CCR7 induziert. Die Zellen werden dann erlaubt, bei der Ratte für 48 Stunden ruhen, bevor Herausforderung durch die Injektion von einem Ohr mit Kochsalzlösung (Kontrollgruppe Ohr) und die andere mit einem 1:1-Mischung von Eizellen und Ova konjugiert Texas-Red (Ova-TR) zur Visualisierung ermöglichen der ansässigen Antigen-präsentierenden Zellen. Wir beschreiben eine Methode, Gewebe Vorbereitung nützlich für die Bildgebung die Motilität von Zellen in den tiefen Hautschichten während einer Immunantwort in Verbindung mit Visualisierung von Kollagenfasern durch Erzeugung der zweiten Harmonischen. Ear Gewebe in 5 x 5 mm Quadrate (etwas größer ist besser) geschnitten und auf Kunststoff Deckgläser mit Vetbond ™, die dann gesichert werden mit Silikonfett in einem bildgebenden Kammer und superfundiert durch Sauerstoff-Blasen Gewebekultur-Medium bei 37 ° C .

Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer verzögerten Typ-Überempfindlichkeit (DTH)-Reaktion bei der Ratte Ohr. Dies wird durch eine Demonstration der Vorbereitung der Ratte Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der Effektor / Memory T-Zell-Antwort folgte.

Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Die verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion (Delayed Type Hypersensitivity, DTH) ist eine Immunreaktion, bei der CCR7-Effektor- und Gedächtnis-T-Lymphozyten die Hauptrolle spielen. Hier demonstrieren wir eine ...

Hallo, ich bin Melanie Matthew. Ich bin Doktorandin im Labor von Micah Hollins an der University of California Irvine im Fachbereich Physiologie und Biophysik. Und heute werden wir gemeinsam mit Dr. Christine Beaton zeigen, wie wir die reagierende Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellpopulation im Rattenohr abbilden.Dr. Christine Beaton wird zuerst eine verzögerte Hypersensitivitätsreaktion (DTH) im Rattenohr auslösen. Anschließend werden wir zur in-situ-Bildgebung des Rattenohrs mittels Zweiphotonenmikroskopie übergehen. Vor zwei Tagen habe ich GFP-markierte, albuminspezifische T-Zellen in eine Lewis-Ratte injiziert.Und heute werde ich dieselbe Ratte am Ohr herausfordern. Im rechten Ohr werde ich Albumin injizieren. Und im linken Ohr werde ich lediglich etwas PBS injizieren.Die Dosis an Albumin, die ich injiziere, beträgt 20 Mikrogramm in 20 Mikroliter. Das verwendete Albumin ist eine 1:1-Mischung aus mit Texas Red markiertem und unmarkiertem Albumin. Dies ist die Aufnahme, auf der ich Ihnen zeigen werde, wie ich die Injektion durchführe.Ich habe also meine linke Hand, ich bin Rechtshänder. An meiner linken Hand habe ich den Handschuh abgenommen, um einen Finger unter das Ohr und den a

imaging-effector-memory-t-cells-ear-after-induction-adoptive

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie die aktive DTH in Lewis-Ratten induzieren und Überwachung der entzündlichen Reaktion.

Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T (TEM)-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie um Antigen-spezifische TEM-Zellen zu aktivieren, bewegen Adoptiveltern DTH in Lewis-Ratten und überwachen die entzündliche Reaktion.

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Generierung von T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gibt einen alternativen Ansatz der Verwendung von embryonalen Stammzellen für die T-Zell-basierten Immuntherapie. Verfahren zeigt, dass durch Verwendung von...

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Wir beschreiben eine wertvolle diagnostische Assays, die möglicherweise verwendet werden könnten, um den Abzug der Immunsuppression nach der Transplantation ohne erhöhten Risiko einer Abstoßungsreaktion zu entscheiden. Der Test basiert auf den Grundsätzen der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und liefert genaue Beurteilung der beiden Spender spezifischen Effektor-und regulatorischen Immunantworten durch Empfänger montiert.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um chronisches experimentelles Autoimmun-Trockenauge in Lewis-Ratten durch Immunisierung mit einer Emulsion von Ratten-Tränendrüsenextrakt, Ovalbumin und komplettem Freund-Adjuvans zu induzieren, gefolgt von der Injektion von Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin in die Forniceal-Subconjunctiva und Tränendrüsen Sechs Wochen später.

Ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell mit Zunahme im Effekt-Speicher T-Zellen in Augapfel-Gewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis

Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

Mausmodell der epikutan induzierten Immunmodulation

Erfahren Sie die Induktion von DTH im Rattenohr und die Zweiphotonen-Mikroskopie zur Visualisierung von Effektor- und Memory-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die in-situ-Analyse immunologischer Reaktionen.

Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Weitere Videos entdecken