Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Hallo, ich bin Melanie Matthew. Ich bin Doktorand im Micah Hollins Labor an der University of California Irvine in der Abteilung für Physiologie und Biophysik. Und heute zeigen wir Ihnen zusammen mit Dr. Christine Beaton, wie wir den reagierenden Effekt oder die Gedächtnis-T-Zell-Population im Rattenohr abbilden.

Dr. Christine Beaton induziert zunächst eine verzögerte Typüberempfindlichkeit DTH im Rattenohr. Und dann gehen wir zur In-situ-Bildgebung des Rattenohrs mit zwei Fotomikroskopien über. Vor zwei Tagen injizierte ich GFP markiert von albuminspezifischen T-Zellen in hyper zu einem Lewis.

Und heute werde ich die gleiche Ratte im Ohr herausfordern. Also werde ich Albumin in das rechte Ohr injizieren. Und in das linke Ohr werde ich einfach etwas PBS injizieren.

Die Dosis von Albumin, die ich injiziere, beträgt 20 Mikrogramm in 20 Mikrolitern. Und das Albumin, das ich verwende, ist eine Mischung aus Texas Red, markiert mit Albumin und unmarkiert mit Albumin. Das ist also die rechte Ecke, auf der ich Ihnen zeigen werde, wie ich injizieren werde.

Ich habe also meine linke Hand, ich bin Rechtshänder. Also zog ich meine linke Hand aus, um einen Finger unter das Ohr und den anderen nach oben stecken zu können, um die Haut zu dehnen, damit ich mit der Nadel genau sehen kann, wo ich stehe, und zwischen den beiden Hautschichten in die Luft gehen kann, die sehr dünn ist. Dafür verwende ich 27-Gauge-Nadeln, um etwas extrem Dünnes zu haben, das hineinpasst.

Wenn ich es also umdrehe, sehen Sie definitiv, wohin das Texas-Rot und das PBS gegangen ist. Wir sind jetzt 42 Stunden nach der Herausforderung hier drin und ich werde ein federbelastetes Mikrometer verwenden, um die Ohrdicke zu messen. Ich werde also beide Ohren messen, das rechte Ohr, das mit dem Albumin herausgefordert wurde, und das linke Ohr, das nicht herausgefordert wurde, und der Unterschied in Ihrer Dicke gibt uns eine Vorstellung von der Intensität der Entzündung.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 oder 58 oder 57 oder 57. Und das andere Ohr 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton hat uns gerade die Ratte gegeben, die sie nach der Messung der DTH-Reaktion entfernt hat.

Wir haben sie auf Eis hierher transportiert. Dies ist das linke Ohr der Ratte. Und wir sind jetzt hier in Ian Parkers Labor und machen Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Also werde ich diese Ohren für die In-situ-Zwei-Photonen-Bildgebung vorbereiten. Also werde ich eines der Rattenohren hier an der Basis des Ohrs vorbereiten. Das Taschentuch ist viel dicker und wir haben einige Haare, die ein wenig unordentlich werden, wenn ich einfach anfange, sie anzuschneiden.

Das erste, was ich also tun werde, ist, einfach ein paar dieser Haare abzuschneiden. Ich halte mir nur sanft das Ohr. Mein Finger macht es viel einfacher, das Gewebe tatsächlich zu kontrollieren, wenn man ihn zwischen Daumen und Zeigefinger hält.

Ich bevorzuge es, eine Pinzette zu benutzen, weil ich mit einer Pinzette einfach nicht so leicht spüren kann, was das Gewebe tut, und wir sind immer besorgt, das Gewebe zu beschädigen. Wir wollen also in der Lage sein, zu fühlen, was wir damit machen. Also benutze ich einfach gerne meine Finger.

Dies ist die Hautschicht, die sich von hier im Rattenohr ablöst. Als ich also einen Teil der Haare wegschnitt, konnte ich einige dieser Dermis sanft abschneiden, die sich irgendwie abschälen. Es gibt eine sehr kleine Präparierschere, um das zu tun, nur eine schöne gebogene Schere.

Du willst das Gewebe nicht stechen und kannst dich von der Basis des Ohrs nach oben vorarbeiten, indem du einfach vorsichtig etwas Hautschicht wegschneidest. Wir brauchen also kein sehr großes Fenster für die Bildgebung. Dieser Bereich hier wird ausreichen, um einige schöne Bilder von den Zellen zu bekommen, die das Gewebe infiltrieren.

Sie können also sehen, dass wir hier noch einige intakte Blutgefäße an der Basis des Ohrs und so ziemlich bis zur Spitze des Ohrs haben. Dieser gesamte Bereich eignet sich sehr gut für die Bildgebung von DTH. Also werde ich das Stück Gewebe, das ich belichtet habe, ausschneiden, um ein kleines Stück Gewebe herzustellen, das wir in unserer Bildgebungsphase festkleben können.

Also mach hier einfach einen Schnitt, dreh ihn um. Ich kann hier schneiden. Wir haben ein schönes kleines Stück Gewebe, das wir auf unserem Zwei-Photonen-Teleskop für die Bildgebung vorbereiten können.

Dabei handelt es sich um unzerbrechliche Abdeckfolien aus Kunststoff, die wir auf die Größe unseres Taschentuchs zuschneiden. Und dann montieren wir das Gewebe mit der Wettbindung auf diese. Und dann befestigen wir diese unzerbrechlichen Kunststoff-Deckgläser mit Silikonfett auf unserer Insitu-Bildgebungsstufe.

Ich nehme dieses kleine Stück Luftgewebe, es hat eine kleine Krümmung, also muss ich es beim Festkleben abflachen. Nicht ideal, aber es wird funktionieren. Du nimmst also einfach eines dieser Deckblätter und schneidest es zu, schätzt die Größe deines Ohrs und schneidest es einfach ein bisschen größer, als du denkst, dass es sein wird.

Um unser Taschentuch auf dem Deckglas zu befestigen. Wir verwenden einen gewebesicheren Sekundenkleber namens Bet Long. Wir bekommen es von 3M und geben einfach ein paar Tropfen davon auf unser Deckblatt.

Ich will nicht zu viel haben. Und Sie möchten auch sicherstellen, dass es gleichmäßig verteilt ist. Also nehme ich einfach ein kleines Stück Linsenpapier und benutze die Ecke, um den Kleber über den Deckschirm hier zu leiten.

Ich werde so ein wenig an den zusätzlichen Kleber herangehen und sobald dieser Kleber mit Wasser in Berührung kommt, härtet er aus. Sie sollten also sehr vorsichtig mit Ihrer Gewebeprobe umgehen. Also werde ich die Gewebeecke hier nehmen, die wir wahrscheinlich nicht abbilden werden, weil sie sich auf dem gekrümmten Teil befindet.

Ich werde es nur ein wenig abtrocknen. Die Unterseite, nur auf dem Linsenpapier, damit alles getrocknet ist. Und ich werde die Ecke davon berühren, dieses Rattenohrgewebe auf dem Deckglas.

Und es sollte sofort aushärten, wo ich es berührt habe. Den Rest werde ich nur ein wenig abflachen, indem ich sanft darauf drücke, die Ränder davon. Hoffentlich können wir also einen schönen Bildrahmen haben.

Jetzt werde ich den Kleber aushärten, indem ich ihn in Medien tauche. Um zu verhindern, dass der Kleber auf das Gewebe gelangt, drehen wir ihn auf den Kopf und tauchen ihn langsam eine Ecke zuerst in unser Medienreservoir, und er sollte schön festgeklebt sein und wir können ihn in unserer Bildgebungskammer im Gewebe abbilden. Jetzt werden wir das Stück Gewebe, das wir für die In-situ-Bildgebung vorbereitet haben, das Stück Biergewebe, auf die Bühne bringen.

Hier ist also unser Stück Taschentuch mit dem Silikonfett auf der Unterseite, und wir legen es einfach vorsichtig in den Medienstrom. Jetzt klebt das Silikonfett an den Boden der Bühne. Hellen Sie den Medienfluss mit unserem Temperaturfühler direkt daneben auf.

Und jetzt konzentrieren wir uns. Also werde ich unseren Fokus einschalten, neues Licht, unser helles Peeling. Also nehme ich unser 20-fach-Objektiv und lasse es in die Kammer absenken.

Achte darauf, dass es das Taschentuch nicht berührt. Schauen Sie durch das Okular und fokussieren Sie sich auf unser Ohrgewebe. Und da ist es.

Hier sehen Sie autofluoreszierende grüne Haarfollikel in der Hautschicht des Rattenohrs. Um diese Haarfollikel herum befindet sich eine dichte Kollagenschicht. Dies ist eine Schicht, die wir für die T-Photonen-Bildgebung der T-Fektor-Gedächtniszellen entfernen.

Die autofluoreszierenden Haarfollikel verdecken das Bild ebenso wie das helle Kollagen der oberen Hautschicht. Okay, hier können Sie sehen, dass wir APCs haben, die texanisches rotes konjugiertes Volin aufgenommen haben, und sie sind entlang dieser blauen Kollagenfasern eingebettet. Die Kollagenfasern sind aufgrund der zweiten harmonischen Generation, die wir in die Photonenbildgebung entlang der Kollagenfasern einbringen, blau.

Wir haben hochbewegliche Zellen. Sie kriechen an den Kollagenfasern auf und ab und interagieren mit den APCs. In diesem Video haben Sie gesehen, wie Dr. Christine Beaton adoptives DTH bei der Lewis-Ratte induziert.

Und dann haben wir Ihnen unsere Ohrvorbereitung für die Bildgebung gezeigt, die responsiven T-Effektor-Gedächtniszellen und das Rattenohr und unsere beiden Photonentechniken, um dies zu tun.