Name: Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die Isolation neuronaler Kerne aus postmortalem menschlichem Gehirngewebe mittels Dichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenz-aktiviertem Sortieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung chromatinbasierter DNA-Interaktionen.

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Die Autoren schätzen die Beratung und technische Unterstützung durch Dr. Richard Konz und Personal an der Durchflusszytometrie-Core Facility sofern an der University of Massachusetts Medical School. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center Stipendium DK032520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health (NIMH), das National Institute of Drug Abuse (NIDA) und dem National Institute of Child Health and Human Development unterstützt.

Kerne Extraction <ol><li> Legen Sie 250 mg des gefrorenen postmortem Gehirngewebe in 5 ml Lysepuffer 1 in einem douncer und legen Sie sie auf Eis. So empfangen Sie ca. 5 Millionen Keime nach FACS-Sortierung verwenden wir im allgemeinen 1000 mg Gewebe pro Probe. </li><li> Sobald das Gewebe aufgetaut, Dounce das Gewebe für 1 Minute, während auf dem Eis. </li><li> Nehmen Sie die homogenisierte Gewebe und legen Sie sie in eine 15 ml klare Ultrazentrifuge Röhre. Setzen Sie das Rohr auf dem Eis. </li><li> Nehmen 9 ml Saccharose-Lösung 2 mit einer Pipette, legen Sie die Pipette an der Unterseite des klaren Ultrazentrifuge Rohr, und lassen Sie die Saccharose-Lösung 2 zu einem Konzentrationsgradienten mit dem homogenisierten Gewebe Lösung auf der Oberseite des Saccharose-Lösung 2 zu erstellen. </li><li> Wiegen der Ultrazentrifuge Röhren, um sicherzustellen, dass sie alle werden ausgeglichen, während sich drehenden innerhalb der Ultrazentrifuge werden. Nehmen Sie die Anpassungen, um das Gewicht, indem Lysispuffer 1, um die oberste Schicht. </li><li> Nach dem Röhrchen gewogen wurden, legen Sie sie in den Rotor der Eimer. </li><li> Legen Sie alle Eimer in einen SW28 Rotor und setzt vorsichtig den Rotor in der Ultrazentrifuge. </li><li> Ultrazentrifuge der Proben bei 107163,6 RCF 2,5 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand, zusammen mit der Schicht aus Schutt an der Konzentrationsgradient gefunden, mit dem Einsatz von Vakuum, während man aufpassen, nicht das Pellet enthält die Kerne am Boden des Röhrchens zu stören. </li><li> Add 500 mL 1X PBS in jedes Pellet und lassen Sie sich auf dem Eis für 20 Minuten. Dies ermöglicht das Pellet ein wenig auf seine eigene Auflösung, so dass es später leichter mechanisch löse es durch Auf-und Abpipettieren, die verringert die Menge der Stress der Kerne zu erleben. </li><li> Nach der Kerne auf Eis für 20 Minuten haben inkubiert, mechanisch Pipette auf und ab um sich vollständig aufzulösen die Kerne innerhalb 1XPBS. </li><li> Entfernen Sie die Kerne-haltigen Lösung aus der Ultrazentrifuge Rohre und kombinieren Sie die Inhalte von zwei Rohren in einem einzigen 2 mL Reaktionsgefäß. Auch hier legen Sie die Proben auf Eis. </li></ol> Immunfärbung für FACS <ol><li> An dieser Stelle, machen Sie eine Immunfärbung Mischung aus primären und sekundären Antikörpers zusammengesetzt und Blocking Mix. Für jede Probe kombinieren 300 ul 1XPBS mit 1,2 ul der NeuN Antikörper, 100 L Blocking Mix, die 0,5% BSA und 10% normales Ziegenserum in 1XPBS und 1 ul Alexa Fluor 488 enthält. Für den Kontrollproben, schließen Sie die primäre Antikörper NeuN und statt dessen einfach mehr 1XPBS. </li><li> Vortex die Immunfärbung Mischung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Während die Färbung Mischung inkubiert, um die Steuerelemente für die Proben. Für FACS-Sortierung, eine Probe, die Kerne allein, die so genannte &quot;ungefärbte Kontrolle&quot; notwendig ist, eine zweite Probe, eine negative Kontrolle, welche die Kerne mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488, ohne den primären Antikörper NeuN auch benötigt wird. </li><li> Aliquot 20 ul der Kerne enthaltenden Lösung in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit 1XPBS für die ungefärbten Kontrolle, und weitere 20 ul in eine andere 2 ml Tube mit 980 uL der 1XPBS für die negative Kontrolle. Erhöhen Sie die Lautstärke der Kerne enthaltenden Probe wieder auf 1 ml mit 1XPBS. Alle Proben sind wieder auf Eis gelegt. </li><li> Nun, da die Immunfärbung Mischung fertig Inkubation, fügen Sie den Inhalt von 401 ul in die entsprechenden Proben. Die Kerne Probe erhalten die Mischung, die sowohl NeuN und Alexa Fluor 488, während die negative Probe der Mischung, die nur den sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 erhalten. </li><li> Nehmen Sie die Proben in den kalten Raum im Dunkeln für 45 Minuten zu drehen. </li><li> Nachdem die Proben im Dunkeln für 45 Minuten inkubiert wurden, legte sie auf Eis und bringt sie zu den FACS-Anlage. Während des Transports in der FACS-Anlage, sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln gehalten werden. </li></ol> FACS <ol><li> Bei der FACS-Anlage, filtern Sie die Proben durch einen 40 um Filter. Dann führen sie durch das Instrument für ein paar Minuten, während sie kalt gehalten, um einige vorläufige Daten vor dem Sortieren zu bekommen. </li><li> An dieser Stelle ist es notwendig, die entsprechenden Tore für die Sortierung gesetzt werden müssen. Mehrere verschiedene Tore sind zu sortieren Proben verwendet. Das erste Tor gibt eine Vorstellung von der Größe der verschiedenen Kerne in der Probe gefunden, und ermöglicht separatation von Schutt von den tatsächlichen Kernen. Das zweite Tor ermöglicht es uns, Kerne einzeln zu sortieren. Entsorgen Sie alle Aggregate sind an dieser Stelle verworfen. Schließlich ist das dritte Tor zu einer bestimmten Fluoreszenzwellenlänge gesetzt, passend, dass der Fluorochrom in unserem sekundären Antikörper gefunden. Platzieren dieses Tor ermöglicht es uns, zu sortieren und trennen NeuN +, also neuronale Kerne aus NeuN - Kernen. </li><li> Nach all den Toren gewählt sind, können die Kerne in 1XPBS sortiert werden. </li><li> Sobald dergesamte Probe durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Art, indem Sie einen aliquoten Teil der Probe sortiert durch das Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Fluoreszenz nicht ausgebreitet, sondern in einem einzigen Quadranten enthalten. Am besten ist es Proben, die mehr als 90% rein sind zu wählen. </li></ol> Nach FACS <ol><li> Sobald die Probe wurde sortiert, kann beginnen Verarbeitung der Kerne. Nehmen Sie sich 10 mL Probe sortiert und fügen Sie 2 ml Saccharose-Lösung 2, 50 ul 1 M CaCl 2 und 30 ul von 1m Mg (Ace) 2. Zur Erinnerung: immer sicher sein, um die Probe auf Eis zu halten, da die Kerne unfixierten sind. </li><li> Wenn es weniger als 10 ml sortiert Probe, die Lautstärke zu erhöhen bis zu 10 mL, indem 1XPBS, oder stellen Sie die zusätzlichen Materialien entsprechend. </li><li> Kehren Sie die Probe mehrmals und auf Eis für 15 Minuten. </li><li> Nachdem die Proben auf Eis für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert sie in einer Schaukel Eimer Rotor bei 1786 RCF für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand mit dem Einsatz von Vakuum, ohne die weiße Pellet am Boden des Röhrchens gefunden. </li><li> Lösen Sie das Pellet in 200 ul, was für Sie optimalen Lösung für das Verfahren Experimente und Pipette auf und ab. </li><li> Übertragen Sie die Lösung in ein kleineres Rohr und legen Sie sie in die -80 ° C Gefrierschrank bis zur weiteren Verwendung. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

Das Protokoll hier vorgestellten sollte besonders nützlich für Studien zu epigenetischen Veränderungen der neuronalen Chromatin und ganz allgemein ausgerichtet, auf der molekularen Phänotyp der neuronalen Zellkern, während der normalen Entwicklung und Alterung, oder in neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen. Die Methode ist von besonderem Vorteil, wenn die zelluläre Heterogenität des Hirngewebes, einschließlich der möglichen Verschiebungen in Neuron-to-Glia Ration im Verlauf des Alterns oder wegen Krankheit eine Sorge 1...

Reagenzien: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysispuffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Sucrose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Saccharose-Lösung </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sucrose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce Puffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Der pH-Wert auf 7,5 und das Volumen auf 200 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table>

neuronale kerne isolation von human postmortem gehirngewebe

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronen im menschlichen Gehirn postmitotischen weitgehend geworden während der pränatalen Entwicklung, und behalten so ihre Kerne während der gesamten Lebensdauer. Es ist jedoch wenig über die Änderungen in der neuronalen Chromatin und nukleare Organisation im Laufe der Entwicklung und Alterung, oder bei chronischen neuropsychiatrischen Krankheit bekannt. Doch bis heute die meisten Chromatin und DNA basierenden Tests (außer Fisch) fehlen einzelne Zelle Auflösung. Zu diesem Zweck stellt die erheblichen zellulären Heterogenität des Hirngewebes eine erhebliche Einschränkung, denn in der Regel verschiedene Subpopulationen von Neuronen mit verschiedenen Arten von Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen vermischt. Eine mögliche Lösung wäre, Zelltyp-spezifische Kulturen wachsen, aber die meisten ZNS-Zellen, einschließlich Neuronen, sind ex vivo eine nachhaltige, am besten, denn nur ein paar Wochen und somit würde ein unvollständiges Modell für epigenetische Mechanismen potentiell Betriebskosten über die gesamte Lebensdauer liefern . Hier bieten wir ein Protokoll zu extrahieren und zu reinigen Kerne aus gefrorenem (nie fest) menschlichen post mortem Gehirn. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion der Kerne in hypotone Lyse-Puffer, durch Ultrazentrifugation und immunotagging mit anti-NeuN-Antikörper. Labeled neuronale Kerne werden dann separat mit Fluoreszenz-aktivierter Sortierung gesammelt. Diese Methode sollte für jede Region des Gehirns in eine Vielzahl von Arten und für Chromatinimmunpräzipitation Studien mit Ort-und Umbau-spezifischen anti-Histon-Antikörper, und für die DNA-Methylierung und andere Assays.

Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Neuronen im menschlichen Gehirn werden weitgehend während der pränatalen Entwicklung postmitotisch und behalten daher ihre Zellkerne über die gesamte Lebensspanne bei. Jedoch ...

Um die Chromatin-DNA-Interaktionen zu untersuchen, die die neuronenspezifische Genexpression im menschlichen Gehirn steuern, muss zunächst eine reine Population neuronaler Kerne gewonnen werden. Postmortales menschliches Hirngewebe wird homogenisiert und die gesamten Kerne mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Anschließend werden die Kerne mit neuronenspezifischen Antikörpern markiert, die über die Flusszytometrie sortiert werden, und abschließend durch Ultrazentrifugation angereichert.Hallo, ich bin Anish Matan aus dem Labor von Dr. Sharon mc Barian hier in der Abteilung für Psychiatrie der University of Massachusetts Medical School. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Isolierung neuronaler Kerne aus postmortalen menschlichen Hirngeweben. Beginnen wir also.Für jede zu sortierende Kernprobe beginnen Sie mit tausend Milligramm gefrorenem postmortalen Hirngewebe. Mit dieser Menge können Sie nach der fluoreszenzaktivierten Sortierung etwa 5 Millionen neuronale Kerne erhalten. Um die Kernextraktion zu beginnen, geben Sie 250 Milligramm Hirngewebe in einen Douncer, der fünf Milliliter Lysepuffer enthält, und stellen Sie ihn auf Eis.Nachdem das Gewebe aufgetaut ist, kühlen

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Verfahren mittels Laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren RNA aus einer homogenen Zellpopulation, pyramidalen Neuronen in der Schicht III des oberen temporalen Gyrus in postmortalen menschlichen Gehirnen. Wir anschließend linear verstärken (T7-based) mRNA und hybridisieren die Probe auf die Affymetrix menschlichen X3P Microarray.

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe. Die isolierten Einzelkerne können als Proben für Sequenzierungstechniken wie die Einzelkern-RNA (snRNA)-Sequenzierung und die Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin (snATAC)-Sequenzierung verwendet werden, um tiefere Einblicke in die inter- und intratumorale Heterogenität zu erhalten, die bei Gliomen des zentralnervösen Gewebes beobachtet wird.

Isolierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe: Eine Methode zur Gewinnung intakter Zellkerne aus Gliomtumorproben

Das Video zeigt eine Methode zur Isolierung intakter Zellkerne aus Glia- und Stammzellen im Hippocampus dentatus Gyrus (DG) der Maus. Das DG-Gewebe wird in einem kalten Homogenisierungspuffer mechanisch dissoziiert, um die Zellkerne freizusetzen. Gewebetrümmer und andere freigesetzte Organellen werden verworfen, und die Zellkerne werden mit einer DNA-Färbung und einem Fluorophor-konjugierten Antikörper gefärbt, der spezifisch für das neuronale nukleäre Antigen (NeuN) ist. Die...

Eine Technik zur Isolierung von Zellkernen aus nicht-neuronalen Zellen im Gyrus dentatus des Hippocampus

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung und Sortierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem menschlichem Hirngewebe mittels fluoreszenzaktivierter Kernsortierung (FANS), das die Untersuchung verschiedener Zellpopulationen für verschiedene neurologische Anwendungen ermöglicht.

Isolierung von Zellpopulationen aus Hirngewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Hier wird eine Methode zur Sequenzierung einzelner Kerne, die aus dem Gyrus dentatus der Maus isoliert wurden, vorgestellt, die die meisten Neuronen durch Fluoreszenz-aktivierte Kerne (FAN)-Sortierung ausschließt. Dieser Ansatz generiert qualitativ hochwertige Expressionsprofile und erleichtert die Untersuchung der meisten anderen Zelltypen, die in der Nische vertreten sind, einschließlich seltener Populationen wie neuraler Stammzellen.

Fluoreszenzaktivierte Kerne negative Sortierung von Neuronen kombiniert mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der neurogenen Hippocampus-Nische

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.

Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays

Lernen Sie die Isolation neuronaler Kerne aus postmortalem menschlichem Gehirngewebe mittels Dichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenz-aktiviertem Sortieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung chromatinbasierter DNA-Interaktionen.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

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