Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Um die Chromatin-DNA-Interaktionen zu untersuchen, die die neuronale spezifische Genexpression im menschlichen Gehirn steuern, muss zunächst eine reine Population von neuronalen Kernen gewonnen werden, um dies zu tun. Postmortales menschliches Hirngewebe wird homogenisiert und die Gesamtkerne werden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Dann werden die Zellkerne mit neuronalen spezifischen Antikörpern markiert, durch flussmetrische Sortierung isoliert und schließlich durch Ultrazentrifugation konzentriert.

Hallo, ich bin Anish Matan aus dem Labor von Dr. Sharon mc Barian hier in der psychiatrischen Abteilung der University of Massachusetts Medical School. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von neuronalen Kernen aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie für jede zu sortierende Zellkernprobe mit tausend Milligramm gefrorenem postmortalem Hirngewebe. Mit dieser Menge kann man nach einer fluoreszenzaktivierten Sortierung etwa 5 Millionen Neuronalkerne erhalten. Um mit der Extraktion der Zellkerne zu beginnen, geben Sie 250 Milligramm Hirngewebe in einen Downer mit fünf mil Lysepuffer und legen Sie ihn auf Eis.

Einmal taut das Gewebe eine Minute lang auf dem Eis auf. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe nach dem Absenken in ein durchsichtiges 15-mil-Ultrazentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen dann auf Eis. Wiederholen Sie diese Homogenisierung für das verbleibende Gewebe.

Als nächstes pipettieren Sie vorsichtig neun mil Saccharoselösung auf den Boden der Ultrazentrifugenröhrchen, um einen Konzentrationsgradienten so einzurichten, dass die homogenisierte Gewebelösung auf der Saccharoselösung liegt. Wiegen Sie nun die Ultrazentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass sie während der Ultrazentrifugation ausbalanciert sind. Nehmen Sie alle Gewichtsanpassungen vor, indem Sie der obersten Schicht Lysepuffer hinzufügen. Nachdem die Röhrchen gewogen wurden, legen Sie sie mit dem Rotor der Ultrazentrifugenproben SW 28 für 2,5 Stunden bei vier Grad bei 107163,6 RCF in die Ultrazentrifuge.

Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie sowohl die Snat als auch die Schicht der Ablagerungen ab, die sich am Konzentrationsgradienten befinden. Achten Sie darauf, das Pellet am Boden des Röhrchens, das die Kerne enthält, nicht zu stören. Geben Sie dann 500 Mikroliter eines XPBS zu jedem Pellet und lassen Sie es 20 Minuten lang auf Eis ruhen.

Nach 20 Minuten werden die Pellets durch Auf- und Abpipettieren durch Reanimation suspendiert. Die Inkubation auf Eis ermöglicht es den Pellets, sich ein wenig von selbst aufzulösen, was es einfacher macht, die Kerne wieder zu suspendieren, wodurch der Stress, dem die Kerne ausgesetzt sind, verringert wird. Übertragen Sie dann die Reanimationssuspende und die Kerne in zwei Mil-Zentrifugenröhrchen.

Kombinieren Sie die Nukleinsäurelösung aus zwei der Ultra-Centage-Röhrchen mit jedem Mikrozentrifröhrchen und legen Sie die Proben erneut auf Eis. Nachdem die Nukleinextraktion abgeschlossen ist, werde ich zum Schritt der Immunfärbung übergehen, um neuronale Kerne zu isolieren. Tatsächlich wird die Sortierung der Probe, die Kerne enthält, mit einer Immunfärbemischung inkubiert, die aus primären und sekundären Antikörpern besteht, sowie mit blockierenden Verbindungen, um die Immunfärbemischung bei 1,2 Mikrolitern neuronalem spezifischem Antikörper neues N bis 300 Mikroliter eines XPBS herzustellen. Fügen Sie dann hundert Mikroliter Blockierungsmischung hinzu, die 0,5 % BS, A und 10 % Normalcode-Serum in einem XPBS enthält.

Zum Schluss fügen Sie einen Mikroliter des Sekundärantikörpers LOR 4 88 hinzu. Bereiten Sie auch einen Immunfleck für eine negative Kontrollprobe für diese Immunfleckenmischung vor. Schließen Sie das neue Ende des Primärantikörpers aus und ersetzen Sie es durch 1,2 Mikroliter eines XPBS.

Wirbeln Sie nun Immunfärbemischungen vor und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, während die Färbemischungen inkubieren. Bereiten Sie die Kontrollkeimproben für die negative Kontrollprobe Eloqua vor: 20 Mikroliter der Reanimationsspannenkerne werden in ein Zwei-mil-Röhrchen mit 980 Mikrolitern eines XPBS gegeben. Bereiten Sie auch eine ungefärbte Kontrolle vor, die nur die Zellkernlösung und PBS enthält.

Eloqua geben nun 20 Mikroliter der Zellkerne in ein anderes Röhrchen und erhöhen das Volumen mit einem XPBS wieder auf ein mil. Legen Sie dann alle Proben wieder auf Eis. Inzwischen sind die Immunfärbemischungen fertig.

Inkubieren 401 Mikroliter der Mischung in die entsprechende Probe geben. Die Zellkernprobe erhielt das Gemisch, das sowohl neue als auch LOR 4 88 enthielt. Die negative Kontrollprobe erhielt ein Gemisch, das nur den Sekundärantikörper LOR 4 88 enthielt, während der ungefärbten Kontrollprobe keine Immunfärbung zugesetzt wurde.

Übertragen Sie anschließend die Proben in das Claron und drehen Sie sie 45 Minuten lang im Dunkeln. Jetzt, da die 45-minütige Inkubation abgeschlossen ist, werde ich die Proben zur Durchflusszytometrie-Kernanlage der University of Massachusetts Medical School bringen, um eine fluoreszenzaktivierte Sortierung durchzuführen. Während des Transports zur Kernanlage sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln aufbewahrt werden. In der Kernanlage für Durchflusszytometrie werden die Proben zunächst durch einen 40-Mikron-Filter gefiltert und dann einige Minuten lang durch das Gerät geleitet, während sie kalt gehalten werden.

Dies geschieht, um vor dem Sortieren einige vorläufige Daten zu erhalten. Die ungefärbte Kontrolle bestimmt den Grad der negativen Fluoreszenz. Stellen Sie auf der Grundlage dieser Informationen die Empfindlichkeit des Geräts auf Fluoreszenz ein.

Die fleckige Kontrolle wird zur Bekämpfung der Grippe verwendet. Jegliches Hintergrundrauschen aufgrund von Fluoreszenzabweichung an dieser Stelle setzt die entsprechenden Gates, die für die Sortierung erforderlich sind. Zur Sortierung der Proben werden mehrere verschiedene Gates verwendet.

Hier sind einige typische Daten für das erste Tor. Dieses Fax-Analysediagramm zeigt eine repräsentative Stichprobe nach dem Justieren des Gates. Das erste Gatter erkennt Muster von Trümmern und lebensfähigen Kernen basierend auf einer Kombination von Einstellungen wie Fluoreszenz und allgemeiner visueller Erfahrung.

Die X-Achse stellt die Vorwärtsstreuung dar, die der relativen Größe entspricht, während die Y-Achse die Standortstreuung berücksichtigt, die die interne Komplexität wie die Granularität berücksichtigt. Das erste Tor kann auch eine Vorstellung von der Größe der verschiedenen Kerne geben, die in unserer Probe gefunden wurden. Dies ermöglicht es, die Trümmer von den eigentlichen Kernen zu trennen, und hier sind einige typische Daten vom zweiten Tor.

Dieses Faxdiagramm zeigt ein Beispiel für ein zweites Gate, das es ermöglicht, Kerne einzeln zu sortieren, während alle Aggregate verworfen werden. Dieses Gate untersucht die unterschiedlichen Zeitspannen, die Kerne benötigen, um den Laser zu durchlaufen. Diejenigen, bei denen es sich um Zuschlagstoffe handelt, brauchen normalerweise länger, um durchgelassen zu werden.

Dieser spezielle Parameter ist sehr wichtig, da der Einschluss von Aggregaten die Reinheit beeinträchtigen kann, da einige fluoreszierende Kerne an nicht fluoreszierende Kerne gebunden sein können. Zum Schluss noch ein paar typische Daten aus dem dritten Gate. Dieses Gate ist auf eine spezifische Fluoreszenzwellenlänge eingestellt, die mit der des Fluorons in unserem Sekundärantikörper übereinstimmt.

In diesem Faxdiagramm sehen Sie den Fluoreszenzpegel entlang der x-Achse und einen tiefroten Kanaldetektor, PECY sieben entlang der y-Achse. Diese Punktflecken ergeben eine bessere Darstellung, wenn sie einfach mit einem einfarbigen Histogramm verglichen werden. Das Platzieren von SCADA ermöglicht es, neue und positive neuronale Kerne von neuen und negativen nicht-neuronalen Kernen zu sortieren und zu trennen.

Nachdem alle Gatter ausgewählt sind, werden die Kerne in ein XPBS sortiert. Sobald die gesamte Probe die Faktensortierung durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Sortierung, indem Sie ein Eloqua der sortierten Probe durch das Gerät laufen lassen. Hier ist ein Beispiel für ein optimales Ergebnis.

Vergleichen Sie hier die Vorsortierungsprobe, die eine gemischte Population der Kerne enthält, mit der sortierten Eloqua, die die meisten negativen Kerne eliminiert hat. Beachten Sie, dass die Reinheitsprozentsätze auf der Anzahl der Ereignisse basieren, die die Probe auf der Grundlage der festgelegten Gates kontaminieren. Denken Sie daran, dass beim ersten Durchlauf der Probe durch die Maschine ein gewisses Bleichen auftreten kann, was zu einer gewissen Verdunkelung führt, um dies zu berücksichtigen, müssen möglicherweise einige Anpassungen vorgenommen werden.

Sobald die Probe sortiert ist, beginnen Sie mit der Verarbeitung der Zellkerne. Zu diesem Zweck entnehmen Sie 10 mil der sortierten Probe und fügen Sie zwei mil Saccharoselösung, 50 Mikroliter eines molaren Calciumchlorids und 30 Mikroliter eines molaren Magnesiumacetats hinzu. Wenn weniger als 10 mil sortierte Probe vorhanden sind, erhöhen Sie das Volumen auf 10 mil, indem Sie einen XPBS hinzufügen oder die zusätzlichen Materialien entsprechend anpassen.

Anschließend die Probe mehrmals umdrehen und 15 Minuten auf Eis legen. Nach 15 Minuten wird die Zentrif-Feature-Probe 15 Minuten lang bei vier Grad in einem Ausschwingrotor 1, 786 RCF entnommen. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgesaugt, ohne das weiße Kügelchen am Boden des Röhrchens zu stören.

Lösen Sie dann das Pellet in 200 Mikrolitern der entsprechenden Lösung auf, die für die vorangegangenen Versuche benötigt wurde. In diesem Fall lösen wir das Pellet und den Downing-Puffer für das nachfolgende Chip-Experiment auf. Suspendieren Sie dann das Pellet mit einem Rohr auf und ab.

An diesem Punkt können Sie die Zellkerne in ein kleineres Röhrchen überführen und in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius legen. Bis zur weiteren Verwendung, nun, ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man neuronale Kerne aus menschlichem postmortalem Hirngewebe isoliert. Mit diesen Zellkernen können Sie eine Reihe verschiedener Analysen durchführen, wie z. B. die Chromatin-Immunpräzipitation.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Proben immer auf Eis zu halten, da die Kernwaffen nicht fixiert sind und sich bei langer Temperatur zersetzen können. Außerdem ist es wichtig, menschliches Gewebe mit Biosicherheitsstufe zwei oder höheren Sicherheitsstandards zu behandeln. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.