A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

In dem Dowling-Labor untersuchen wir die Physiologie und Entwicklung der Netzhaut bei Zebrafischen, um festzustellen, ob Zebrafisch-Mutanten, die nicht in der Lage sind, Bewegungen wahrzunehmen, dennoch Licht erkennen können und nicht blind sind. Dazu testen wir ihre visuelle motorische Reaktion oder VMR. Wir sammeln Zebrafische etwa vier Tage nach der Befruchtung.

Bringen Sie sie in 96-Loch-Platten an, bereiten Sie eine geeignete Aufnahmekonfiguration vor, richten Sie die Video-Tracking-Software auf die Platte aus und verfolgen Sie dann die motorische Reaktion der Fische nach dem Wechsel von Hell zu Dunkel oder Dunkel zu Hell, was wir als VMR bezeichnen. Hallo, ich bin Farida Imran aus dem Labor von John Dowling und der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Biologie an der Harvard University.

Und ich bin Jason Rio. Ich komme aus dem Labor von Alexander Shear, ebenfalls aus der Abteilung für molekulare und zelluläre Biologie an der Harvard University. Heute werden wir Ihnen die visuelle motorische Reaktion von Zebrabärblingen auf Lichtzunahme und -abnahme zeigen.

Beginnen wir also. Um den visuellen Motorantwort-Test zu starten, ziehen Sie zunächst Wildtyp-Zebrafischlarven in einem Dunkel-Hell-Zyklus bei 28 Grad Celsius heran, und zwar mindestens bis zu vier Tagen nach der Befruchtung. Unser typischer Licht-Dunkel-Zyklus umfasst 14 Stunden eingeschaltetes Licht, beginnend um 9:00 Uhr morgens, und 10 Stunden ausgeschaltetes Licht, beginnend um 23:00 Uhr, um optimale Verhaltensergebnisse zu erzielen.

Vermeiden Sie eine Überbelegung der Larven. Üblicherweise halten wir nicht mehr als 50 Larven in einer einzigen Petrischale. Nach fünf Tagen post fertilization überführen wir die Zebrafische in eine 96-Well-Platte mit einem Wells-Volumen von 650 µL, um den Larven ausreichend Schwimmraum zu bieten.

Überführen Sie mit einer Plastik-Transferpipette vorsichtig jeweils eine Larve pro Vertiefung. Nach dem Überführen der Fische in die Vertiefungen füllen Sie jede Vertiefung mit ausreichend Fischwasser auf, sodass die Wasseroberfläche nahezu bis zum oberen Rand der Vertiefungen reicht. Achten Sie darauf, die Vertiefungen weder über- noch unterzufüllen, um optische Probleme für die Aufnahmekamera zu vermeiden.

Achten Sie außerdem darauf, keine Blasen in die Vertiefungen einzubringen. Die Fische sind nun bereit, hinsichtlich ihrer lokomotorischen Reaktionen auf Licht und Dunkelheit überwacht zu werden. Bringen wir die plattierten Zebrafische zur Aufnahmeeinrichtung.

Beginnen wir nun mit der Überprüfung der Aufzeichnungsvorrichtung. Die 96-Well-Platte, die die Fische enthält, wird in dieser weißen Schale innerhalb der Aufnahmekammer platziert und mit einer Feder oder einem Gummiband fixiert. Die Kamera befindet sich hier hinten im Gehäuse und ist mithilfe von Spiegeln an der Oberseite des Gehäuses, die sich hier befinden, auf die Platte fokussiert.

Der Winkel dieser Spiegel kann durch Drehen der Schrauben, die die Spiegel fixieren, verstellt werden. Die Aufnahmekammer wird von unten durch Infrarot-LEDs beleuchtet. Dies ermöglicht es der Kamera, die Fische auch im Dunkeln aufzuzeichnen.

Die Larven können IR-Licht nicht wahrnehmen, daher beeinflusst diese konstante IR-Beleuchtung das Experiment nicht. Weiße LEDs beleuchten ebenfalls die Aufnahmekammer von unten. Sie werden unabhängig von den IR-Lichtquellen gesteuert, um Experimente zu ermöglichen, die länger als einige Stunden dauern.

Die Kammer kann mit langsam fließendem Wasser gefüllt werden, um über die Dauer des Experiments eine konstante Temperatur aufrechtzuerhalten. Das Wasser wird mithilfe einer kleinen Aquariumspumpe aus einem Reservoir gepumpt und mit einem handelsüblichen Unterwasser-Aquariumheizer auf 28 Grad erhitzt. Das Wasser fließt durch ein großes Abflussloch ab und wird in das Reservoir zurückgeführt, um störende Vibrationen aus dem Raum zu minimieren.

Die gesamte Aufnahmeeinheit steht auf einem schweren Balancetisch. Wenn die Aufzeichnungsvorrichtung bereit ist, wird ein Kastendeckel verwendet, um die Tiere abzudecken und sie zusätzlich vor Licht zu schützen. Fahren wir nun mit der Ausrichtung der 96 fort.

Mehrbrunnenplatte mit dem Computer-Raster der Video-Tracking-Software zuerst platzieren, die 96-Loch-Platte mit den Fischen in die Aufnahmekammer geben. Bei Verwendung eines Wasserbades für Langzeitexperimente die Platte langsam ins Wasser stellen, um dem Wasserspiegel die Möglichkeit zu geben, sich anzupassen, ohne auf die Platte zu verschütten. In der Ansicht der Video-Tracking-Software überprüfen, ob alle Larven und das Experiment auf dem Computerschirm sichtbar sind.

Stellen Sie mithilfe der Softwaresteuerung das Raster der Video-Tracking-Software so auf die Vertiefungen der 96-Loch-Platte ein, dass sich jeder Fisch innerhalb eines Rasterfelds befindet. Dieser Schritt ist für alle Ihre Aufnahmen äußerst wichtig. Der Tracking-Computer berechnet die Bewegung für jedes dieser Felder separat.

Wenn Sie das Computer-Raster falsch ausrichten, können einige Fischbewegungen verloren gehen oder noch schlimmer. Zwei benachbarte Fische nehmen denselben Bereich ein und werden nach der Ausrichtung als ein Fisch gezählt. Die Zeiten, zu denen das Licht ein- und ausgeschaltet wird, sind im Computer programmiert.

Üblicherweise gewähren wir drei Stunden leichte Dunkeladaptation in der Box. Dies dient nicht nur dazu, ein Basisaktivitätsniveau zu erzielen, sondern gibt den Larven auch die Möglichkeit, sich nach dem Pipettieren und der Handhabung zu beruhigen. Anschließend schließen wir die Tür der Aufnahmekammer und beginnen mit der Aufzeichnung.

In der Praxis erfassen wir die Aktivität jedes Fisches pro Sekunde, aber die Ansichtssoftware zeichnet tatsächlich bilddatenweise die Daten auf. Unterhalb des Bildschirms sehen Sie eine Echtzeitaufzeichnung eines einzelnen Fisches. Bezüglich der Pixelbewegung zeigt die weiße Linie an, dass die Anzahl der Pixeländerungen unterhalb einer festgelegten Schwelle liegt, während die grüne Linie angibt, dass die Pixeländerung über der Schwellwerteinstellung liegt.

Der Schwellenwert hängt teilweise von Ihrer speziellen Kamera- und Beleuchtungskonfiguration ab. Bei unserer Konfiguration verwenden wir typischerweise einen Schwellenwert von vier Pixeln. Das bedeutet, wenn weniger als vier Pixel sich ändern, wird dies als Hintergrund betrachtet.

Wenn mehr als vier Pixel sich bewegen, bedeutet dies, dass sich der Fisch bewegt. Wir haben empirisch festgestellt, dass diese Schwelle nahezu alle Schwimm- und Drehbewegungen der Larven erfasst. Obwohl die Aufnahmefelder die Larven recht gut isolieren, schalten wir dennoch das Licht im Raum aus und achten darauf, mechanische Störgeräusche wie das Schließen und Öffnen von Türen, eine Tanzveranstaltung oder unsere Trainingsroutinen auf ein Minimum zu reduzieren.

Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, übertragen Sie die gesammelten Daten in eine Excel-Tabelle oder in Ihre bevorzugte Analyse-Software. So sehen die Daten aus. Sie enthalten die Zeit in Sekunden seit Beginn des Experiments sowie die Aktivität jeder Larve pro Sekunde.

Hier ist ein Diagramm, das die Aktivität einer einzelnen Larve über die gesamte Dauer des Experiments zeigt, wobei mehrere Ein- und Ausschaltreaktionen durch die Pfeile im Diagramm angegeben sind. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche Aktivität von 40 Fischen über die gesamte Dauer des Experiments, wobei mehrere Ein- und Ausschaltreaktionen wie durch die Pfeile angezeigt dargestellt sind. Wie Sie sehen können, sind die Ein- und Ausschaltreaktionen deutlich und konsistent.

Dieses Experiment zur visuellen motorischen Reaktion kann auch an mutierten Fischen durchgeführt werden. Für diese Studien platzieren wir typischerweise Wildtyp-Fische und mutierte Fische im Schachbrettmuster auf derselben Platte, um optimale Kontrollbedingungen zu gewährleisten. Wenn mutierte Fische auf derselben Platte wie Wildtyp-Fische verwendet werden, stellen Sie sicher, dass Sie notieren, welcher Fischtyp in jedem.Well platziert wurde.

Hier ist ein Vorschlag, wie man die in jedem Brunnen platzierten Fische verfolgen kann. Hier sind die Ergebnisse der visuellen motorischen Reaktion, die Wildtyp- und Mutantenlarven vergleichen. Auch hier beobachten wir deutliche und konsistente Ein- und Ausschaltreaktionen bei den Wildtyp-Larven.

Dagegen erhöhen die Larven des chalk-Mutanten, die keine Augenentwicklung aufweisen, ihre Aktivität weder signifikant bei Lichtzunahme noch bei Lichtabnahme und weisen ein niedriges Grundniveau der Aktivität auf. Diese Ergebnisse vergleichen die Reaktionen des Wildtyps mit denen der NO-OKR-Mutanten, auch NRC-Mutanten genannt. Man ging davon aus, dass die NRC-Mutante aufgrund des OKR-Tests vollständig blind ist.

Mithilfe des VMR-Tests zeigen wir, dass der NRC-Mutant eine normale Abschaltreaktion sowie eine verzögerte und träge Ansprechreaktion aufweist. Somit ist der NRC-Mutant nicht vollständig blind, wie bisher angenommen wurde. Wir haben Ihnen soeben die visuell motorische Reaktion von Zebrafischen auf Lichtzunahme und -abnahme gezeigt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Experiment tagsüber durchzuführen, da Fische tagsüber aktiver sind und stärker auf Änderungen der Lichtintensität reagieren als nachts. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.