Methylierte DNA Immunpräzipitation

Dieses Video zeigt ein Protokoll für die Immunpräzipitation oder das Meetup mit methylierter DNA. Eine Methode, mit der methylierte DNA auf unvoreingenommene Weise spezifisch isoliert werden kann. Die DNA-Methylierung bei Säugetieren ist gekennzeichnet durch die Addition einer Methylgruppe an die C-Fünf-Position von Cytosin.

Wenn es in einem CPG-Dinukleotid enthalten ist, handelt es sich um eine reversible epigenetische Markierung, die eine wichtige Rolle bei der normalen Entwicklung sowie bei mehreren Krankheitsprozessen spielt. Zu den normalen Funktionen der DNA-Methylierung gehören die Inaktivierung des X-Chromosoms bei Frauen, das Silencing repetitiver Elemente, die genomische Prägung und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Es wurde auch gezeigt, dass die DNA-Methylierung eine Rolle bei zahlreichen Krankheiten wie Krebs, dem der-Willi-Syndrom, dem Engelman-Syndrom und Immunschwäche, Zentrimerinstabilität und Gesichtsanomalie-Syndrom spielt.

Bei Krebserkrankungen zum Beispiel können abnormale Hypermethylierung und Promotoren dazu führen, dass lebenswichtige Tumorsuppressorgene zum Schweigen gebracht werden. Während eine unsachgemäße Hypomethylierung zu chromosomaler Instabilität und Onkogenaktivierung führt, wird die Meetup durch das erste Sonic Skaten der DNA in Fragmente mit einer Größe von 300 bis 1000 Basenpaaren erreicht. Anschließend wird die beschallte DNA bei 95 Grad Celsius denaturiert.

Primäre Antikörper, die fünf Prime-Methazin erkennen, werden hinzugefügt und lassen methylierte DNA-Fragmente binden. Sekundäre Antikörper, die an magnetische Dyna-Kügelchen konjugiert sind, werden verwendet, um DNA-Fragmente zu isolieren, die vom primären Antikörper gebunden wurden. Unmethylierte Fragmente werden entfernt und die Antikörper werden durch Proteinase verdaut.

Bei der KA-Phenylchloroform-Reinigung wird das verdaute Protein entfernt und die DNA durch Fällung gereinigt, die nun mit methylierten Fragmenten angereichert ist. Meetup, DNA kann für Anwendungen wie PCR-Microarrays und Sequenzierung verwendet werden. Das Meetup wird in der Regel als zweitägiges Verfahren durchgeführt.

Der erste Tag umfasst die DNA-Vorbereitung, die Beschallung, die Immunpräzipitation und den Proteinverdau. Der zweite Tag umfasst die pH-Extraktion von Chloroform und die Ethanolfällung, um die für die Methylierung angereicherte DNA zu reinigen und zu isolieren. Es gibt einige spezielle Materialien, die für das Treffen erforderlich sind, darunter silikonisierte Zentrifugenröhrchen, ein DNA-Sonnengerät, ein primärer Antikörper, eine Anti-Fünf-Prime-Methazin-Maus, ein monoklonaler Antikörper, ein sekundärer Antikörper, Dyna-Kügelchen, konjugiert mit Schafen, Anti-US-IgG und ein magnetisches Röhrchengestell.

Der erste Schritt im Meetup-Protokoll ist die Vorbereitung der DNA. Es ist zwingend erforderlich, die Art der DNA im Voraus zu beurteilen. Es ist erforderlich, den Zustand der Proben-DNA zu kennen, unabhängig davon, ob sie hauptsächlich doppel- oder einzelsträngig ist, da eine genaue Quantifizierung der Probe von größter Bedeutung ist und verschiedene Methoden zur Bestimmung der DNA-Menge durch das Vorhandensein unerwünschter DNA-Spezies nachteilig beeinflusst werden können.

Die doppelsträngige DNA-Menge kann einfach durch spektrale Photometrie mit einem NanoDrop 3 bestimmt werden, 300 nd laden 1,5 Mikroliter und stellen Sie den Messtyp auf Nukleinsäure ein, wählen Sie DNA 50 als Berechnung und initialisieren Sie das Gerät mit 1,5 Mikrolitern Wasser. Reinigen Sie die Sockel und befeuchten Sie das Instrument mit 1,5 Mikrolitern der Flüssigkeit. Die Probe wird in sauberer Luft aufgelöst, die Sockel laden 1,5 Mikroliter der Probe und die Messung treffen.

Die Konzentration wird angegeben und kann verwendet werden. Um die für mich benötigte Anzahl an Mikrolitern zu berechnen, ist hier ein A zwei 60 zu zwei 80 Verhältnis von 1,8 ideal. Es wird eine Probe von einem Mikrogramm vorbereitet.

Eine Probe von nur 200 Nanogramm reicht jedoch aus, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Laden Sie für das Treffen die DNA-Probe in ein sauberes silikonisiertes Röhrchen. Fügen Sie ausreichend steriles Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 50 Mikroliter zu bringen.

DNA Ultraschall und Immunpräzipitation müssen in silikonisierten Röhrchen durchgeführt werden, um eine unspezifische Bindung von DNA und Proteinen an die Röhrchenwände zu verhindern. Sobald die DNA vorbereitet wurde, muss die Probe mit Schallschall beschallt werden, um die DNA zu fragmentieren, da die Immunpräzipitation bei kleineren DNA-Fragmenten effizienter ist, laden Sie die Probe in das Ultraschallat, stellen Sie sicher, dass die Leistungseinstellung auf hoch eingestellt ist und dass die Maschine auf 30 Sekunden eingestellt ist. Füllen Sie den Boden nach 30 Sekunden aus mit vier Grad Celsius Wasser in die Fülllinie.

Die Probe sieben Minuten lang beschallen. Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Schlauch und legen Sie ihn auf Eis. Es ist wichtig, die Beschallungsbedingungen für Ihre erwartete Probe und die DNA-Größe im Voraus zu optimieren.

Zum Beispiel erfordert eine teilweise abgebaute DNA-Probe eine kürzere Beschallungszeit. Ultraschallprodukte können mit Standard-Elektrophoretiktechniken visualisiert werden. DNA-Fragmente mit einer Größe von 300 bis 1000 Basenpaaren sind an dieser Stelle für die spätere Verwendung erwünscht.

Bei Microarray- und PCR-Assays sollten Sie ein Fünftel Ihrer DNA als Eingangs- oder Referenz-DNA reservieren, in diesem Fall werden 800 Nanogramm beschallte DNA für die Immunpräzipitation verwendet und der Rest wird als Referenz-DNA beiseite gelegt. Der nächste Schritt im Medienprotokoll ist die Immunpräzipitation oder IP-Reaktion, bevor der Primärantikörper, die DNA, denaturiert werden muss. Eine Denaturierung ist erforderlich, da der Primärantikörper empfindlich auf einzelsträngige DNA reagiert.

Legen Sie die Probe 10 Minuten lang in ein Wasserbad bei 95 Grad Celsius. Wenn der Denaturierungsschritt abgeschlossen ist, stellen Sie das Rohr sofort für mindestens fünf Minuten auf Eis. Dies verhindert, dass die denaturierte DNA in die Knie geht, und ermöglicht eine optimale Antikörperbindung, wenn die Probe abgekühlt ist.

Drehen Sie das Rohr kurz, um den Inhalt nach unten zu ziehen. Als nächstes sollte der primäre Antikörper hinzugefügt werden. Die Menge des verwendeten Antikörpers sollte für jede Charge und für jeden Hersteller titriert werden.

In diesem Fall fügen wir fünf Mikrogramm Primärantikörper hinzu und fügen dann Immunpräzipitationspuffer oder IP-Puffer zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Als nächstes wird die IP-DNA in einen Rotator gegeben und zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubiert. Eine Rotation ist erforderlich, um eine Antikörperkonglomeration innerhalb des Röhrchens während der Inkubation zu verhindern.

Etwa 15 Minuten bevor die Inkubation des Primärantikörpers abgeschlossen ist, reinigen und bereiten Sie die magnetischen Dyna-Kügelchen vor. Zuerst die Kügelchen in der Durchstechflasche durch Vortexen gründlich resuspendieren. Übertragen Sie dann 30 Mikroliter Kügelchen in ein sauberes silikonisiertes Röhrchen und platzieren Sie dieses Röhrchen auf einem Magnetgestell für mehrere Reaktionen.

Übertragen Sie 30 Mikroliter Kügelchen pro Reaktion, plus genug für eine zusätzliche Reaktion, um Pipettierfehler oder versehentlichen Verlust einiger Beads zu vermeiden. Zum Beispiel für acht Reaktionen. Entfernen Sie genügend Kügelchen für neun Reaktionen oder 270 Mikroliter.

Die magnetischen Kügelchen werden zur Wand des Magnetgestells gezogen. Warten Sie zwei Minuten, bis die Kügelchen wandern und sich zu einem definierten Streifen an der Tubenwand absetzen. Entfernen Sie anschließend die überstehende Pipette und entsorgen Sie sie vorsichtig, wobei Sie darauf achten sollten, die Perlen an der Rückwand nicht mit der Pipettenspitze zu stören.

Ersetzen Sie den Überstand durch ein überschüssiges Volumen des IP-Pufferwirbels und legen Sie ihn für zwei Minuten wieder auf das Magnetgestell. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal und suspendieren Sie die Waschperlen wieder in ihrem ursprünglichen Volumen an IP-Puffer. Nehmen Sie das Probenröhrchen aus dem Rotator, wenn die Inkubation abgeschlossen ist.

Um die Immunpräzipitation abzuschließen, fügen Sie der Reaktion 30 Mikroliter saubere Kügelchen hinzu und legen Sie das Röhrchen für zwei Stunden bei vier Grad Celsius wieder in einen Rotator. Während dieser Inkubation bindet der sekundäre Antikörper, bei dem es sich um Anti-Maus-IgG handelt, an den primären Maus-Antikörper. Die Anti-Maus-Antikörper sind an magnetische Dyna-Kügelchen konjugiert, was eine einfache Rückgewinnung der gebundenen Produkte und den anschließenden Reinigungsschritt ermöglicht.

Sobald die Inkubation mit beiden Antikörpern abgeschlossen ist, legen Sie das IP-Röhrchen für zwei Minuten auf das Magnetgestell. Zu diesem Zeitpunkt wird die methylierte DNA an den primären Antikörper gebunden, der wiederum an den dyna-bead-konjugierten Sekundärantikörper gebunden wird. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter IP-Puffer.

Mischen Sie den Inhalt der Tube und stellen Sie sie für zwei Minuten wieder auf den Rost. Wiederholen Sie diese Wäsche mit IP-Puffer noch einmal. Nachdem Sie den Überstand von der letzten Resus-Wäsche entfernt haben, hängen Sie die Kügelchen ein letztes Mal auf.

In 400 Mikroliter Aufschlusspuffer wird die Reaktion mit 100 Mikrogramm Proteinase K behandelt und über Nacht bei 50 Grad Celsius inkubiert. Die Proteinase-K-Behandlung ist notwendig, um die Antikörperproteine und alle mit der DNA assoziierten Restproteine zu verdauen, so dass die methylierte DNA in Lösung freigesetzt werden kann. Die DNA-Reinigung wird am zweiten Tag des Meetup-Verfahrens durchgeführt, das Verdauungsröhrchen wird aus dem Inkubator entnommen.

Geben Sie in einem Abzug 500 Mikroliter Eins-zu-Eins-Phänochloroform bei pH sieben in das Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen gründlich 10 Minuten lang bei 13.000 durch. G.Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase aus dem Röhrchen, ohne die Grenzfläche zu stören oder die organische Schicht zu entfernen. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen.

Eine zweite Extraktion kann durchgeführt werden, wenn die Benutzeroberfläche wolkig erscheint. Fügen Sie als nächstes ein 10. Volumen von drei molaren Natriumacetat hinzu, in diesem Fall 40 Mikroliter. Ein Mikroliter Glykogen kann als Träger verwendet werden, um die Reinigung von Pellets zu erleichtern.

Wirbeln Sie das Rohr vor, um den Inhalt zu mischen. Fügen Sie dann zwei Volumen 100% Ethanol hinzu, wirbeln Sie es und frieren Sie es nach dem Einfrieren 20 Minuten lang in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius ein. Die gefällte DNA wird in einer Zentrifuge bei 13.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten heruntergeschleudert.

Am Boden des Röhrchens bildet sich ein DNA-Kügelchen. Nehmen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und entfernen Sie das Ethanol. Achten Sie darauf, das Pellet am Boden des Rohrs nicht zu stören.

Ein Impulsspin kann erforderlich sein, um Ethanolreste zu entfernen. Um das Pellet zu waschen, fügen Sie 500 Mikroliter kalten, 70%igen Ethanol-Wirbel hinzu und schleudern Sie erneut 20 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Wenn die zweite Drehung abgeschlossen ist, entfernen Sie die 70%ige Ethanol-Impulsdrehung und entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer Pipette.

Lassen Sie das Rohr bei geöffneter Kappe auf einem Rost, um das Pellet zu trocknen und das restliche Ethanol verdampfen zu lassen. Schließlich suspendiert Reus das Pellet, das nur DNA enthält, die für die Methylierung angereichert ist, und 10 Mikroliter steriles Wasser, so dass das DNA-Pellet vor der Verwendung genügend Zeit hat, sich aufzulösen. Es empfiehlt sich, die Meetup-Kenntnisse durch PCR zu validieren.

Dies kann durch das Ausführen von PCR-Reaktionen erreicht werden, die entwickelt wurden, um Produkte zu amplifizieren, die methylierte und unmethylierte DNA-Fragmente für die Amplifikation normaler menschlicher DNA-Primer unterschiedlich darstellen. Die H-19-Prägungskontrollregion kann in Verbindung mit Primern verwendet werden, die dazu bestimmt sind, eine Region des Genoms zu amplifizieren, die nicht methyliert ist. Beispielhafte Primersequenzen und PCR-Zyklusbedingungen können im begleitenden Protokoll gefunden werden.

An dieser Stelle ist es notwendig, die Eingabe- oder Referenz-DNA abzurufen, die zu Beginn des Meetup-Protokolls beiseite gelegt wurde. Ein Satz von PCR-Reaktionen wird unter Verwendung der Eingangs-DNA aufgebaut, und der andere Satz verwendet die für die Methylierung angereicherte IP-DNA. Wenn das Treffen erfolgreich war, wird die IP-PCR ein Produkt mit den Methylierungsprimern und kein Produkt mit den Kontrollprimern herstellen.

Umgekehrt sollte die Input-PCR Produkte herstellen, die beide Primer verwenden, da sie sowohl methylierte als auch unmethylierte Primer enthält. DNA-Fragmente. DNA, die mit methylierten Fragmenten angereichert ist, kann für eine Reihe von Downstream-Anwendungen verwendet werden, wie z. B. PCR-Sequenzierung und Microarray-Analyse.

In Kombination mit anderen molekularbiologischen Techniken kann es verwendet werden, um den Methylierungsstatus der DNA auf locusspezifische oder genomweite Weise für die Erstellung von Methylierungsprofilen oder die Untersuchung der Epigenomik zu untersuchen.