Name: Methylierte DNA Immunpräzipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Lernen Sie die Methode der methylisierten DNA-Immunpräzipitation (MeDIP) zur spezifischen Isolierung methylierter DNA. Dieses zweitägige Protokoll nutzt Antikörper gegen 5-Methylcytosin und ermöglicht epigenetische Studien zu Entwicklung und Krankheit.

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Wir wünschen den Mitgliedern des Brown und Lam-Labors für ihre Teilnahme an der kritischen Beurteilung dieses Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research und Michael Smith Foundation for Health Research unterstützt.

DNA-Extraktion und Probenvorbereitung DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben (kultivierten Zellen, Frischplasma sowie Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Gewebe) kann für MeDIP verwendet werden. Es ist wichtig, hochreine DNA ohne assoziierte Proteine ​​wie Histone verwenden. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich zu entfernen RNA aus der Probe, wie es mit den beiden DNA-Quantifizierung und Antikörperbindung stören können. Die DNA-Menge für MeDIP verwendet werden kann von 200 ng bis 1 ug je nach der Menge der DNA verfügbaren Bereich. Um dies zu demonstrieren Protokoll wird 1 pg DNA verwendet werden. Das folgende Protokoll wird eine hohe Qualität doppelsträngigen DNA aus kultivierten Zellen. Andere Protokolle sollten für die Extraktion von DNA aus anderen Probentypen eingesetzt werden. <ol><li> Add 400 ul der Verdauung Puffer, um sich ein Zellpellet in einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add 100 ug Proteinase K, um das Rohr, beimpft und über Nacht bei 50 ° C. </li><li> Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3 bis 5 einmal. </li><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Add 40 ug RNase A und Inkubation 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 11 bis 13 einmal. </li><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Add 1:10 Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und gut mischen. </li><li> Add 2 Bände (900 ul) von 100% Ethanol, gut mischen und bei -20 ° C für 20 Minuten. </li><li> Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol. </li><li> Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren. </li><li> An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen. </li><li> Resuspendieren DNA in 50 ul sterilisiert dH2O Nacht bei 4 ° C. </li><li> Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer NanoDrop. Ein A ​​260: A 280-Verhältnis von 1,8 ist ideal. </li><li> Bestimmen DNA Qualität und Größenordnung auf einem Agarosegel mit 100 bp Leiter. So wenig wie 10 ng der genomischen DNA kann auf einem 1,7% Agarosegel laufen gelassen werden, gefolgt von Färbung mit einem Farbstoff, der sehr empfindlich auf kleine Mengen an DNA wie SYBR Gold ist. </li><li> In einem silikonisierten Röhrchen pro Probe vorzubereiten 1 ug DNA in einem Gesamtvolumen von 50 ul mit dem Rest der Band machte sich mit einem sterilisierten dH 2 O. </li></ol> DNA Beschallung DNA Beschallung und die MeDIP Protokoll muss in siliconzied Rohren durchgeführt werden, um unspezifische Bindung von Proteinen an Rohrwandungen zu verhindern. Optimale Beschallung Zeiten für die DNA-Proben werden nach dem Grad der DNA-Probe Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) bestimmt wird. Zum Beispiel sollten DNA aus kultivierten Zellen extrahiert von sehr hohem Molekulargewicht, und wird nachträglich verlangen mehr Beschallung als DNA von Archivalien Proben, die oft teilweise abgebaut extrahiert. Wenn Proben gleichmäßig hohem Molekulargewicht sind, ist es an dieser Stelle sinnvoll, mit der Beschallung in diesem Protokoll, ohne zu überprüfen jede Probe einzeln beschrieben vorgehen. Wenn Proben mit archivalischen Proben fragmentiert sind, wird es notwendig sein, um die Beschallung Verfahren wahrscheinlich durch eine Verringerung der Beschallung mal bis 300-100bp Fragmente erhalten anzupassen. Wenn Sie erwarten, dass Proben, die teilweise abgebaut, Optimierung von Ultraschall-Parameter können auf einer repräsentativen Stichprobe von denen Interesse durchgeführt werden, zu verarbeiten. Basierend auf den Grad der DNA-Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) beobachtet, kann der Experimentator im Voraus die optimale Beschallung Zeit für die Probe. Hier beschreiben wir eine Methode, um 300-1000 bp DNA-Fragmente durch Beschallung erhalten eine automatisierte Beschallung Gerät (Bioruptor aus Diagenode, UCD-200 TM) mit hohem Molekulargewicht DNA. <ol><li> Wasser in Biorupter müssen bei 4 ° C. </li><li> Mit Ultraschall für 7 Minuten auf die automatischen Einstellungen (30 sec auf 30 sec off bei maximaler Leistung). </li><li> Entfernen 800 ng (40 ul) beschallt Produkt und in silikonisierten 1,7 ml Zentrifugenröhrchen für die Immunpräzipitation (IP)-Reaktion. </li><li> Beiseite restlichen 200 ng (10 ul), die als Eingabe dienen (IN) Referenz-DNA (lagern bei 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON von methylierter DNA <ol><li> Denaturieren die DNA, die für IP Reaktion (800 ng) bei 95 ° C wird für 10 Minuten in einem Wasserbad verwendet. </li><li> Coole sofort auf Eis. Lassen DNA vollständig abkühlen lassen (ca. 5 min auf Eis), bevor Sie fortfahren mit dem nächsten Schritt. </li><li> Add 5 ug monoklonaler Antikörper. </li><li> Fügen Sie IP-Puffer (verwendet bei Raumtemperatur in diesem Protokoll) auf ein Endvolumen von 500 ul. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C in Drehrohr Inhaber. </li><li> Kurz vor Schritt 5 abgeschlossen ist, bereiten Dynabeads durch Waschen (Schritte 6-11). Zunächst resuspendieren die Perlen gründlich in die Flasche durch Vortexen. </li><li> Transfer-30 pl (~ 2 x 10 7) des resuspendierten Dynabeads pro Reaktion plus 1, in eine neue silikonisierten Röhrchen (zum Beispiel, wenn dabei 8 Reaktionen, entfernen Sie genug Kugeln für 9, als 270 ul). </li><li> Das Röhrchen wird auf die magnetische Ablage für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette aus dem Überstand. Beim Entfernen Überstand, berühren Sie die Perlen gegen Innenwand (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten und resuspendieren die Perlen in einem Überschuss Volumen von IP-Puffer (750 ul-1000 ul). Das Röhrchen wieder auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal, und dann resuspendieren gewaschenen Beads in IP-Puffer in das ursprüngliche Volumen in Step 7 entfernt. </li><li> Add 30 ul gewaschen Dynabeads jedem IP Reaktion </li><li> Inkubieren in einem Drehrohr Halter für 2 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation abgeschlossen ist, setzen Sie den Schlauch auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette aus dem Überstand. Berühren Sie nicht die Innenwand des Rohres (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze. Add 500 ul von IP-Puffer. Mix der Inhalt des Röhrchens und legte sie zurück auf die magnetische Ablage für 2 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche mit 500 ul IP-Puffer einmal. </li><li> Nach dem Entfernen der Überstand aus der letzten Waschung resuspendieren die Perlen in 400 ul der Verdauung Puffer. </li><li> Behandeln Sie die Reaktion mit 100 ug Proteinase K und Inkubation über Nacht bei 50 ° C. </li></ol> REINIGUNG VON immunpräzipitiert DNA <ol><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und gründlich vortexen. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, wenn die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Schichten trüb erscheint. </li><li> Add 1 / 10 th Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und Wirbel. </li><li> Add 1 ul Glykogen (20 ug / ul) und Wirbel. </li><li> Add 2 Bände (1000 ul) von 100% Ethanol, vortexen und bei -20 ° C für 20 Minuten. </li><li> Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol. </li><li> Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Vortex kurz und drehen sich mit 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren. </li><li> An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen. </li><li> Resuspendieren DNA-Pellet in 10 ul sterilisiert dH 2 0. </li></ol> VALIDIERUNG VON PCR <ol><li> Sie können testen, um sicherzustellen, dass Ihre MeDIP Verfahren wird durch Ausführen der MeDIP Protokoll mit normalen menschlichen DNA (männlich oder weiblich) arbeiten, und anschließend Testen einer Region bekannt für Methylierung angereichert werden. </li><li> Nehmen Sie 30% der MeDIP Produkt PCR-Röhrchen, und weitere 30% der MeDIP Produkt auf ein anderes PCR-Röhrchen. </li><li> Setzen Sie 10 ng IN DNA in ein PCR-Röhrchen und 10 ng IN DNA in eine andere PCR-Röhrchen. Sie sollten nun vier separate PCR-Reaktionen einzurichten. </li><li> Führen Sie die PCR mit H19 und STRG-Primer wie in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Bereiten Sie zwei Mastermix (eine für jedes Primer-Set) für PCR-Reaktionen mit 12,5 ul Gesamtvolumen wie in Tabelle 2 dargestellt. </li><li> Thermocycle der PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 dargestellt. </li><li> Run 5 ul der PCR-Produkte auf einem 2% Agarosegel für die Visualisierung. </li><li> Die erwarteten Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP sind in Tabelle 4 dargestellt. </li></ol> Tabellen Tabelle 1: H19 und STRG-Primer für PCR-Validierung. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer Set </td><td> Vorwärts-Primer </td><td> Reverse-Primer </td><td> Erwartete Produkt-Größe </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (Kontrolle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Mastermix für die PCR-Reaktionen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (pro Rxn) </td><td> CTRL Mix (pro Rxn) </td></tr><tr><td&gt; ddH 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> 10x Buffer </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP-Mix (10 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Grundierungen (H19_F / R oder CTRL_F / R) (10 uM jedes F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. PCR thermocyling Bedingungen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05.00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00.30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00.30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00.15 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Erwartete PCR-Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Template DNA </td></tr><tr><td> Primer verwendet </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positiv </td><td> Positiv </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positiv </td><td> Negativ </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
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</ol>

Es gibt ein wachsendes Bewusstsein für die wichtige Rolle der DNA-Methylierung spielt in Krankheit, sind daher die Entwicklung von Assays, um diese Änderung zu messen zunehmend an Bedeutung 3, 12, 13. Die MeDIP Technik ist ein Werkzeug für das Screening zugänglich sowohl den gesamten Genoms und Locus-spezifische Level 6, 7. Diese Technik bietet eine schnelle Ansicht von DNA-Methylierungs-Ebenen mit begrenzten Mengen an Ausgangs-DNA und ermöglicht eine einfache Vergleiche zwischen verschiedenen Quel...

<table><tbody><tr><td>Biorupter-Sonikator</td><td>Werkzeug</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1,7-ml-SafeSeal-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sonstiges</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND-3300-Spektrophotometer</td><td>Werkzeug</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primärantikörper: Anti-5&amp;rsquo;-Methylcytosin-Maus-mAb</td><td>Reagenz</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper: Dynabeads M-280 Schaf-anti-Maus-IgG</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Röhrchenständer</td><td>Werkzeug</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Werkzeug</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP-Puffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05 % Triton X-100. Bei Raumtemperatur gelagert</td></tr><tr><td>Verdauungspuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5 % SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

methylierte dna immunpräzipitation

Methylated DNA Immunoprecipitation

Die Identifizierung von DNA-Methylierungs-Muster ist ein übliches Verfahren in der Studie der Epigenetik, wie Methylierung ist bekannt, dass mit erheblichen Auswirkungen auf die Genexpression haben, und ist mit der normalen Entwicklung sowie Krankheit beteiligt<sup&gt; 1-4</sup&gt;. So ist die Fähigkeit, zwischen methylierter DNA und nicht methylierter DNA zu unterscheiden wesentlichen für die Erzeugung Methylierung Profile für solche Studien. Methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) ist eine hocheffiziente Technik zur Gewinnung von methylierter DNA aus einer Probe von Interesse<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Eine Probe von weniger als 200 ng der DNA ist ausreichend für den Antikörper oder Immunpräzipitation (IP), Reaktion. DNA in Fragmente mit einer Größe von 300-1000 bp beschallt, und ist in immunpräzipitiert (IP) und Eingang (IN) Abschnitte unterteilt. IP DNA wird anschließend Hitze denaturiert und dann mit anti-5&#39;mC inkubiert, so dass der monoklonale Antikörper an methylierte DNA binden. Danach werden magnetische Kügelchen mit einem sekundären Antikörper mit einer Affinität für den primären Antikörper zugegeben und inkubiert. Diese Wulst-linked Antikörper binden die monoklonalen Antikörper in der ersten Stufe eingesetzt. DNA gebunden an die Antikörper-Komplex (methylierte DNA) wird aus dem Rest der DNA mit Hilfe eines Magneten, um die Komplexe zu ziehen aus der Lösung getrennt. Mehrmaligem Waschen mit IP-Puffer werden dann durchgeführt, um die ungebundenen, nicht-methylierte DNA zu entfernen. Das methylierte DNA / Antikörper-Komplexe werden dann mit Proteinase K verdaut, um die Antikörper so dass nur die methylierte DNA intakt zu verdauen. Die angereicherte DNA wird durch Phenol gereinigt: Chloroform-Extraktion an das Protein Stoffe zu entfernen und dann gefällt und in Wasser resuspendiert für die spätere Verwendung. PCR-Techniken können verwendet werden, um die Effizienz der MeDIP Verfahren durch eine Analyse der Amplifikationsprodukte von IP und IN DNA für Regionen bekannt, Mangel und bekannte methylierte Sequenzen enthalten validieren. Das gereinigte methylierte DNA kann dann für Locus-spezifischen (PCR) oder genomweite (Microarray-und Sequenzierung) Methylierung Studien verwendet werden, und ist besonders nützlich, wenn sie in Verbindung mit anderen Forschungs-Tools wie Genexpressions-Profiling-und Array-vergleichende Genom-Hybridisierung angewendet ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Weitere Untersuchungen in der DNA-Methylierung wird die Entdeckung von neuen epigenetischen Zielen, was wiederum nützlich sein bei der Entwicklung von neuen therapeutischen oder prognostischen Forschungsinstrumente für Krankheiten wie Krebs, die von methylierter DNA charakterisiert werden kann dazu führen,<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

Die Identifizierung von DNA-Methylierungsmustern ist ein gängiges Verfahren in der Epigenetikforschung, da bekannt ist, dass die Methylierung signifikante Auswirkungen auf ...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll für die immunpräzipitierte methylierte DNA oder Meetup. Eine Methode, die verwendet wird, um methylierte DNA spezifisch und unvoreingenommen zu isolieren. Die DNA-Methylierung bei Säugetieren zeichnet sich durch die Anlagerung einer Methylgruppe an die C5-Position von Cytosin aus.Wenn es in einem CPG-Dinukleotid vorhanden ist, handelt es sich um eine reversible epigenetische Markierung, die eine wichtige Rolle in der normalen Entwicklung sowie bei mehreren Krankheitsprozessen spielt. Zu den normalen Funktionen der DNA-Methylierung gehören die Inaktivierung des X-Chromosoms bei Frauen, die Stilllegung repetitiver Elemente, das genomische Imprinting und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Es wurde außerdem gezeigt, dass die DNA-Methylierung bei zahlreichen Erkrankungen wie Krebs, Prader-Willi-Syndrom, ICF-Syndrom und Immunschwäche, zentromerischer Instabilität und Gesichtsanomalie-Syndrom eine Rolle spielt.Bei Krebserkrankungen kann beispielsweise eine abnormale Hypermethylierung von Promotoren zur Stilllegung wichtiger Tumorsuppressorgene führen. Während eine fehlerhafte Hypomethylierung zu chromosomaler Instabilität und Aktivierung von Onkogenen führt, wird der Nachweis durch erstmaliges Beschallen der DNA in Fragmente mit einer Größe von 300 bis 1000 Basenpaaren erreicht. Die beschallte DNA wird anschließend bei 95 Grad Celsius denaturiert.Primäre Antikörper, die Fünf-Prim-Methazin erkennen, werden hinzugefügt und zur Bindung an methylierte DNA-Fragmente zugelassen. Sekundäre Antikörper, konjugiert an magnetische Dyna-Beads, werden verwendet, um DNA-Fragmente zu isolieren, die durch den primären Antikörper gebunden wurden. Unmethylierte Fragmente werden entfernt und die Antikörper durch Proteinase verdaut.Die KA-Phenol-Chloroform-Reinigung entfernt das verdauten Protein, und die Präzipitation reinigt die DNA, die nun angereichert ist für methylierte Fragmente. Danach kann die DNA für Anwendungen wie PCR, Mikroarray und Sequenzierung verwendet werden. Das Verfahren wird üblicherweise als zweitägige Prozedur durchgeführt.Tag eins umfasst die DNA-Präparation, Sonikation, Immunpräzipitation und Proteolyse. Tag zwei umfasst die pH-abhängige Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung zur Reinigung und Isolierung der methylierungsangereicherten DNA. Für das Verfahren sind einige spezielle Materialien erforderlich, darunter silanisierte Zentrifugenröhrchen, ein DNA-Sonikationsgerät, ein primärer Antikörper, anti-5-Methylcytosin-Maus, monoklonaler Antikörper, sekundärer Antikörper, Dynabeads, konjugiert mit Schafs-anti-Maus-IgG, sowie ein magnetischer Röhrchenhalter.Der erste Schritt im Meetup-Protokoll ist die Vorbereitung der DNA. Es ist unerlässlich, die Beschaffenheit der DNA vorab zu beurteilen. Der Zustand der Proben-DNA, ob sie hauptsächlich doppel- oder einfachsträngig ist, muss bekannt sein, da eine genaue Quantifizierung der Probe von größter Wichtigkeit ist und verschiedene Methoden zur Bestimmung der DNA-Menge durch das Vorhandensein unerwünschter DNA-Arten negativ beeinflusst werden können.Die Menge doppelsträngiger DNA kann einfach durch spektrale Photometrie mit einem NanoDrop 3 bestimmt werden. Laden Sie 1,5 Mikroliter auf und stellen Sie den Messmodus auf Nukleinsäure ein, wählen Sie DNA 50 als Berechnungsmethode und kalibrieren Sie das Gerät mit 1,5 Mikrolitern Wasser. Reinigen Sie die Messflächen und führen Sie eine Blindmessung mit 1,5 Mikrolitern der Flüssigkeit durch. Die Probe ist in der Lösung enthalten: Reinigen Sie die Messflächen, geben Sie 1,5 Mikroliter der Probe auf und drücken Sie „Messen“.Die Konzentration wird angegeben und kann verwendet werden. Um die Anzahl der benötigten Mikroliter für mich zu berechnen, tauchen Sie ein A zwei 60 bis zwei 80 Verhältnis von 1,8 ist hier ideal. Eine Ein-Mikrogramm-Probe wird hergestellt.Jedoch reicht eine Probe von nur 200 Nanogramm aus, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Für das Meeting geben Sie die DNA-Probe in ein sauberes, silikonisiertes Röhrchen. Geben Sie so viel steriles Wasser hinzu, dass das Endvolumen 50 Mikroliter beträgt.Die DNA-Sonikation und Immunpräzipitation müssen in silikonisierten Röhrchen durchgeführt werden, um unspezifische Bindung von DNA und Proteinen an die Röhrchenwände zu verhindern. Sobald die DNA vorbereitet wurde, muss die Probe sonisiert werden, da die Fragmentierung der DNA erforderlich ist, da die Immunpräzipitation mit kleineren DNA-Fragmenten effizienter ist. Laden Sie die Probe in den Sonikator, stellen Sie sicher, dass die Leistung auf hoch eingestellt ist, und dass die Maschine auf 30 Sekunden eingestellt ist. Nach 30 Sekunden Pause füllen Sie den Basisbehälter bis zur Füllmarkierung mit vier Grad Celsius kaltem Wasser.Sonicieren Sie die Probe sieben Minuten lang. Sobald die Sonikation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Röhrchen heraus und stellen es auf Eis. Es ist wichtig, die Sonikationsbedingungen vorab für Ihre erwartete Probe und die DNA-Größe zu optimieren.Zum Beispiel erfordert eine teilweise degradierte DNA-Probe eine kürzere Sonikationszeit. Die Sonikationsprodukte können mit Standard-Elektrophoreseverfahren sichtbar gemacht werden. Zu diesem Zeitpunkt werden DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 300 und 1000 Basenpaaren für die spätere Verwendung angestrebt.Bei Mikroarray- und PCR-Analysen sollten Sie ein Fünftel Ihrer DNA zurückbehalten, um als Input- oder Referenz-DNA zu dienen. In diesem Fall werden 800 Nanogramm sonifizierte DNA für die Immunpräzipitation verwendet, der Rest wird als Referenz-DNA aufbewahrt. Der nächste Schritt im Medienprotokoll ist die Immunpräzipitation oder IP-Reaktion. Vor der Zugabe des primären Antikörpers muss die DNA denaturiert werden. Die Denaturierung ist erforderlich, da der primäre Antikörper auf einzelsträngige DNA anspricht.Platzieren Sie die Probe 10 Minuten lang in ein Wasserbad bei 95 Grad Celsius. Sobald der Denaturierungsschritt abgeschlossen ist, überführen Sie das Röhrchen unverzüglich für mindestens fünf Minuten auf Eis. Dies verhindert, dass die denaturierte DNA wieder in ihre ursprüngliche Struktur zurückkehrt, und ermöglicht eine optimale Antikörperbindung, sobald die Probe abgekühlt ist.Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um den Inhalt nach unten zu ziehen. Als Nächstes sollte der primäre Antikörper hinzugefügt werden. Die Menge des verwendeten Antikörpers sollte für jede Charge und jeden Hersteller titriert werden.In diesem Fall geben wir fünf Mikrogramm Primärantikörper hinzu und fügen dann Immunspezifizierungs-Puffer oder IP-Puffer bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Anschließend wird die IP-DNA in einen Rotator gegeben und zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubiert. Die Rotation ist erforderlich, um eine Agglomeration der Antikörper innerhalb des Reaktionsgefäßes während der Inkubation zu verhindern.Etwa 15 Minuten bevor die Inkubation mit dem primären Antikörper abgeschlossen ist, reinigen und bereiten Sie die magnetischen Dyna-Beads vor. Zunächst resuspendieren Sie die Beads im Fläschchen gründlich durch Vortexen. Danach überführen Sie 30 Mikroliter Beads in ein sauberes silanisiertes Röhrchen und stellen dieses Röhrchen für mehrere Reaktionen auf einen Magnetrack. Übertragen Sie 30 Mikroliter Kügelchen pro Reaktion sowie ausreichend für eine zusätzliche Reaktion, um Pipettierfehler oder unbeabsichtigten Verlust einiger Kügelchen auszugleichen. Zum Beispiel für acht Reaktionen: Entnehmen Sie ausreichend Kügelchen für neun Reaktionen oder 270 Mikroliter.Die magnetischen Kügelchen wandern zur Wand des Magnetracks. Lassen Sie zwei Minuten verstreichen, damit sich die Kügelchen zu einem deutlichen Streifen an der Röhrenwand absetzen können. Entfernen Sie anschließend vorsichtig mittels Pipette und verwerfen Sie die Überstände, wobei Sie darauf achten müssen, die Kügelchen an der Rückwand mit der Pipettenspitze nicht aufzuwirbeln.Ersetzen Sie den Überstand durch ein Übermaß an IP-Puffer, wirbeln Sie die Probe und stellen Sie sie erneut für zwei Minuten auf den Magnetrack. Wiederholen Sie diese Waschung ein weiteres Mal und resuspendieren Sie die Waschperlen in ihrem ursprünglichen Volumen an IP-Puffer. Entnehmen Sie die Probenröhrchen vom Rotator, sobald die Inkubation beendet ist.Um die Immunpräzipitation abzuschließen, 30&nbsp;Mikroliter saubere Kügelchen zur Reaktion hinzufügen und das Gefäß für zwei Stunden bei vier Grad Celsius erneut in einen Rotator stellen. Während dieser Inkubation bindet der sekundäre Antikörper, der anti-maus-IgG ist, an den primären Maus-Antikörper. Die anti-Maus-Antikörper sind an magnetische Dyna-Kügelchen gekoppelt, wodurch eine einfache Rückgewinnung der gebundenen Produkte und der folgende Reinigungsschritt ermöglicht werden.Nach Abschluss der Inkubation mit beiden Antikörpern wird das IP-Röhrchen für zwei Minuten auf den Magnetständer gestellt. Zu diesem Zeitpunkt ist die methylierte DNA durch den primären Antikörper gebunden, der seinerseits durch den mit Dynabeads konjugierten sekundären Antikörper gebunden wird. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter IP-Puffer.Mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes und stellen Sie es für zwei Minuten zurück auf das Gestell. Wiederholen Sie diese Waschung mit IP-Puffer ein weiteres Mal. Nach dem Entfernen des Überstandes aus der letzten Waschung Resus suspendieren Sie die Kügelchen zum abschließenden Mal.In 400 Mikroliter Digestionspuffer die Reaktion mit 100 Mikrogramm Proteinase K behandeln und über Nacht bei 50 Grad Celsius inkubieren. Die Behandlung mit Proteinase K ist notwendig, um die Antikörperproteine und jegliche restlichen mit der DNA assoziierten Proteine abzubauen, wodurch die methylierte DNA in Lösung freigesetzt wird. Die DNA-Reinigung wird am zweiten Tag des Meetup-Verfahrens durchgeführt; holen Sie das Digestionsröhrchen aus dem Inkubator.Fügen Sie in einer Abzugshaube 500 µL einer 1:1-Phenol-Chloroform-Lösung bei pH 7 dem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie gründlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten bei 13.000 × g. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase aus dem Röhrchen, ohne die Grenzfläche zu stören oder Anteile der organischen Phase mitzunehmen. Überführen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen.Eine zweite Extraktion kann durchgeführt werden, wenn die Phasengrenze trüb erscheint. Als Nächstes ein Zehntelvolumen dreimolarer Natriumacetat hinzufügen, in diesem Fall 40 µL. Ein Mikroliter Glykogen kann als Träger verwendet werden, um die Pellet-Reinigung zu erleichtern.Vortexen Sie das Gefäß, um den Inhalt zu mischen. Geben Sie anschließend das Doppelte des Volumens an 100 %igem Ethanol hinzu, vortexen Sie erneut und frieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius ein. Nach dem Einfrieren wird die präzipitierte DNA in einer Zentrifuge bei 13.000 × g und 4 °C 20 Minuten lang pellettiert.Ein DNA-Pellet bildet sich am Boden des Röhrchens. Nehmen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und entfernen Sie das Ethanol. Achten Sie darauf, das Pellet am Boden des Röhrchens nicht aufzuwirbeln.Ein Impulszentrifugieren kann notwendig sein, um verbleibenden Ethanol zu entfernen. Zum Waschen des Pellets 500 Mikroliter kalten, 70 %igen Ethanol hinzufügen, vortexen und erneut 20 Minuten bei 13.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Sobald die zweite Zentrifugation abgeschlossen ist, den 70 %igen Ethanol abgießen, kurz zentrifugieren und den restlichen Ethanol mit einer Pipette entfernen.Lassen Sie das Röhrchen auf einem Gestell mit geöffnetem Deckel, damit der Pellet trocknet und der restliche Ethanol verdunsten kann. Schließlich resuspendieren Sie den Pellet, der nur DNA angereichert für Methylierung enthält, in 10 Mikrolitern sterilem Wasser und lassen ausreichend Zeit, damit sich der DNA-Pellet vor der Verwendung vollständig auflösen kann. Es ist empfehlenswert, die Qualität der Isolierung durch PCR zu überprüfen.Dies kann durch die Durchführung von PCR-Ansätzen erfolgen, die so konzipiert sind, dass sie Produkte amplifizieren, welche methylierte und unmethylierte DNA-Fragmente für normale menschliche DNA unterschiedlich darstellen. Die H19-Imprinting-Control-Region kann zusammen mit Primern verwendet werden, die darauf ausgelegt sind, einen Genomabschnitt zu amplifizieren, der nicht methyliert ist. Beispielhafte Primersequenzen und PCR-Zyklenbedingungen sind im beigefügten Protokoll angegeben.An diesem Punkt ist es notwendig, die zu Beginn des Meetup-Protokolls beiseitegelegte Input- oder Referenz-DNA wiederzuverwenden. Ein Satz von PCR-Reaktionen wird unter Verwendung der Input-DNA eingerichtet, ein weiterer Satz unter Verwendung der für Methylierung angereicherten IP-DNA. Falls das Meetup erfolgreich war, wird die IP-PCR ein Produkt unter Verwendung der Methylierungsprimer und kein Produkt unter Verwendung der Kontrollprimer erzeugen.Umgekehrt sollte die Eingabe-PCR Produkte mit beiden Primern erzeugen, da sie sowohl methylierte als auch unmethylierte DNA-Fragmente enthält. DNA, die angereichert ist für methylierte Fragmente, kann für eine Reihe nachgeschalteter Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise PCR-Sequenzierung und Microarray-Analyse.In Kombination mit anderen Methoden der Molekularbiologie kann es verwendet werden, um den Methylierungsstatus der DNA ortsspezifisch oder genomweit für die Methylierungsprofilierung oder die Untersuchung der Epigenomik zu analysieren.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

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