Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Hallo, ich bin Mike Dustin vom Geral Institute und der medizinischen Fakultät der New York University. Heute werde ich Sie durch das Verfahren zur Herstellung unterstützender planarer Biolays zur Untersuchung der immunologischen Synapse führen. Beginnen wir also.

Um den Lipiddoppelschicht herzustellen, bereiten wir eine Lösung aus 20 % Nickel-chelatisierendem Lipid und 80 % Phosphatidylcholin in geeigneten Mengen in einem Glasröhrchen mit ein bis zwei Millilitern Chloroform-Methanol vor. Der erste Schritt besteht darin, das Lösungsmittel unter einem Strom von Stickstoffgas in einem warmen Wasserbad von 30 bis 37 Grad Celsius zu verdampfen. Dies dauert gewöhnlich etwa 15 Minuten.

Entfernen Sie anschließend unter Vakuum jeglichen verbleibenden Lösungsmittel mithilfe eines Lyophilisators für 90 Minuten. Lösen Sie danach die Lipide in einem Puffer aus 2 % Octylglucosid in physiologischer Kochsalzlösung, um eine Endkonzentration von 0,4 Millimolar zu erreichen. Dadurch entsteht eine Lösung gemischter Detergens-Phospholipid-Mizellen zur Bildung von Liposomen.

Sie dialysieren diese Lösung gegen drei Wechsel von Tris-Salzlösung, um das Tensid zu entfernen und Liposomen zu bilden. Üblicherweise arbeiten wir mit Volumina im Bereich von einem Milliliter unter Verwendung von Schläuchen mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und einer Grenzmolekülmasse von etwa 10 Kilodalton und achten darauf, Luftblasen zu vermeiden, während der Schlauch abgeklemmt wird. Diese Lösung wird steril filtriert, die Dialyse unter sauberen Bedingungen durchgeführt und mit mit 70 %igem Ethanol sterilisierten Handschuhen gehandhabt.

Diese Lösung sollte kristallklar sein und unter Argongas gelagert werden, um eine Oxidation zu verhindern. Falls die Lösung trüb ist, haben Sie mehrwandige Vesikel erzeugt und müssen erneut beginnen. Um das Experiment vorzubereiten, müssen wir zunächst bestimmen, wie viel ICAM-1 und MHC bei einer gegebenen Konzentration löslichen Proteins auf einer bestimmten Oberfläche einer Nickelpolyhistidin-Chelat-Bilayer fixiert werden.

Dazu tragen wir Doppelschichten auf fünf Mikrometer durchmessende Glaskügelchen auf. Inkubieren Sie die Glaskügelchen mit Proteinen unter Bedingungen, die denen in den Strömungszellen zur Bildgebung ähneln, und bestimmen Sie anschließend die Dichte der gebundenen Proteine mittels eines fluoriometrischen Durchfluss-Immunoassays. FSI-markierte Antikörper mit bekannter Anzahl von Fluorescein-Molekülen pro Antikörper werden zur Detektion der oberflächengebundenen Proteine verwendet, und Fluorescein-Standardkügelchen dienen zur Kalibrierung des fluoriometrischen Durchflussmessgeräts.

Wir werden Bedingungen etablieren, die denen auf antigenpräsentierenden Zellen ähneln, mit 200 Molekülen pro Quadratmikrometer ICAM-1 und 0,2 bis 20 Molekülen pro Quadratmikrometer I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Komplexe planare Doppelschichten bilden sich spontan, wenn die Liposomen mit Glas fusionieren, jedoch nur, wenn das Glas ordnungsgemäß gereinigt ist. Wir verwenden Piansäurelösung, eine frisch zubereitete Mischung aus Schwefelsäure und 30%igem Wasserstoffperoxid, die jegliches organisches Material zerstört und die Glasoberfläche zudem stark hydrophil macht.

Beim Arbeiten mit Piranha-Lösung tragen wir vollständige Schutzkleidung, einschließlich einer Säureschürze und schwerer säurebeständiger Handschuhe. Der Abfall muss sorgfältig vom organischen Abfall getrennt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Um die saure Piranha-Lösung herzustellen, geben Sie 75 Milliliter konzentrierte Schwefelsäure in einen trockenen Becher und fügen dann vorsichtig 25 Milliliter 30%ige Wasserstoffperoxid hinzu.

Die Lösung erhitzt sich schnell auf über 100 Grad Celsius; anschließend werden die trockenen Deckgläser 15 Minuten lang in die Lösung getaucht. Nach dieser Inkubation in Piranha-Lösung tauchen Sie die Deckgläser in gereinigtes Wasser und spülen sie dann eine Minute lang auf jeder Seite ab. Danach trocknen Sie die Deckgläser unter Verwendung einer Vakuumquelle, um das gereinigte Wasser abzusaugen.

Lassen Sie die Piranha-Lösung abkühlen und fügen Sie sie dem Piranha-Abfallbehälter hinzu, der mit locker sitzendem Verschluss gut gekennzeichnet im Abzug steht, um die Doppelschichten zu bilden. Unser Labor verwendet bi FCS-Zweikammer-Systeme, die den Vorteil einer integrierten Heizung bieten. Das FCS-Zwei-System befindet sich auf einer Edelstahlbasis, die einen mikrofluidischen Verteiler mit einer 0,5 Millimeter dicken oberen Dichtung sowie eine Mikroaquädukt-Platte fixiert, die auf einer Seite mit Indium-Zinn-Oxid beschichtet ist, um eine Heizung bereitzustellen, und auf der anderen Seite eine fluidische Nut aufweist.

Eine staubfreie Dichtung mit 0,25 Millimeter Stärke, die die Höhe der Flusskammer definiert, und eine mit Piranha gereinigte 40-Millimeter-Runddeckglas, auf dem der Doppelschicht gebildet wird, um die Flusszelle zusammenzubauen und ebene Doppelschichten zu erzeugen. Stellen Sie den Verteiler mit den nach oben zeigenden Schläuchen auf eine ebene Fläche. Anschließend setzen Sie die 0,5-Millimeter-Dichtung mit Löchern, die über den fluidischen Schläuchen positioniert sind, auf und stellen sicher, dass sie plan aufliegt.

Platzieren Sie vorsichtig den Mikro-Aquädukt-Objektträger mit den nach oben zeigenden fluidischen Kanälen und stellen Sie sicher, dass er flach aufliegt, ohne nach unten gerichteten Druck auszuüben, bis überprüft ist, dass die Löcher im Objektträger mit den mikrofluidischen Schläuchen ausgerichtet sind. Legen Sie dann die staubfreie 0,25 Millimeter dicke Dichtung mit rechteckigem Ausschnitt auf den Mikro-Aquädukt-Objektträger, sodass der Kanal mit den fluidischen Kanälen übereinstimmt und keine größeren Luftzwischenräume entstehen. Geben Sie bis zu fünf Ein-Mikroliter-Tropfen der Liposomen-Suspension in einem Muster auf die Oberfläche des Mikro-Aquädukt-Objektträgers auf, bei dem der Abstand von Tropfenmitte zu Tropfenmitte jeweils 2,5 Millimeter beträgt. Die fünf Liposomentropfen können unterschiedliche Zusammensetzungen aufweisen, in diesem Fall bilden wir jedoch nur zwei Doppelschichten, eine ohne nickelladende Lipide und eine mit 10 % nickelladenden Lipiden.

Wenn diese Tropfen platziert sind, setzen Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig in einer Bewegung auf die Oberfläche auf und befestigen Sie sie so schnell wie möglich an der Basis. Die Liposomentropfen sollten mit dem Deckglas in Kontakt kommen. Dieser Kontakt sollte nicht unterbrochen werden, da die Doppelschichten wahrscheinlich bereits gebildet wurden und Störungen zu defekten Doppelschichten führen können.

An dieser Stelle ist es wichtig, die Positionen der Doppelschichten mit einigen kleinen Tintenflecken auf dem Objektträger zu markieren, um die Platzierung der Deckgläser am Mikroskop zu erleichtern. Warten Sie 20 Minuten, um sicherzustellen, dass das System im Gleichgewicht ist, und überführen Sie alle Lösungen mithilfe einer 20-Milliliter-Spritze, die mit etwa 20 Zentimetern flexiblen Schlauchs und einem Dreiweghahn verbunden ist. Ein weiterer Anschluss des Hahns wird dann über eine kurze Schlauchstrecke mit der Flusszelle verbunden, um das Totvolumen zwischen dem Hahn und der Flusszelle zu minimieren.

Füllen Sie die Spritze mit heis-pufferter Salzlösung, die Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Glucose und menschliches Serumalbumin enthält. Spülen Sie die Schläuche und den Hahn, um Luftblasen zu entfernen. Anschließend verbinden Sie dies mit den Durchflusszellen und geben fünf Milliliter in einer Bewegung durch, wobei Sie darauf achten, dass keine Luftblasen die Lipiddoppelschicht passieren.

Jetzt haben Sie Ihre Doppelschichten, um die mit Hiss markierten Proteine in die Doppelschicht einzubringen. Diese müssen zunächst mit Casen blockiert und mit Nickel beladen werden. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Casen-Nickel-Ionen-Lösung und verbinden Sie diese mit dem Seitenanschluss, wobei Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.

Nach der Injektion der Lösung 20 Minuten warten, um eine vollständige Blockade zu ermöglichen. Anschließend die Blockierungslösung mit H-B-S-H-S-A aus der 20-Milliliter-Spritze ausspülen. Nun 0,5 Milliliter H-B-S-H-S-A-Lösung injizieren, die das mit Polyhis markierte ICAM-1 und IEK enthält.

In diesem Experiment wird ICAM-1 mit SCI-5 markiert. So können die LFA-1–ICAM-1-Wechselwirkungen durch Abbildung der ICAM-1-Umlagerung in der Doppelschicht verfolgt werden. Geben Sie 30 Minuten Zeit, damit das Protein an die nickelladene Doppelschicht binden kann, während das Protein an der Doppelschicht haftet. Befestigen Sie die Durchflusszelle mit einem speziellen Probenträgereinsatz am inversen Mikroskop.

Verbinden Sie anschließend die Heizelektronik, um das System bei 37 Grad Celsius equilibrieren zu lassen. Verwenden Sie die zuvor angebrachten Markierungen, um die Flusszelle so zu positionieren, dass das Objektiv mit einer der Doppelschichten ausgerichtet ist, und nutzen Sie die Interferenzreflexionsmikroskopie, um die Fokusebene zu bestimmen, indem Sie das reflektierte Lichtbild der Feldblende scharf stellen. Spülen Sie abschließend das nicht gebundene ICAM-1 aus den Flusszellen aus.

Fluoreszenzbilder der Doppelschicht im ICAM-Eins-Kanal im Turf-M- und Weitfeldmodus aufnehmen. Dies dient der Bestätigung der ICAM-Eins-Bindung an der nickelierten Doppelschicht im Vergleich zur nickelfreien Doppelschicht. Die Durchflusszelle ist nun bereit, Zellen aufzunehmen.

Für diese Demonstration verwenden wir ND-T-Zell-Rezeptor-transgene T-Zellen, die mit einem Retrovirus, das GFPs P zap 70 kodiert, transduziert wurden. Wir waschen die Zellen einmal mit H-B-S-H-S-A und inkubieren sie anschließend mit einem mit Alexa 568 markierten FAB gegen den T-Zell-Rezeptor, um die TCR-Mikrocluster verfolgen zu können. Nach 15 Minuten verdünnen wir die Zellen im Verhältnis 1:10. Dadurch wird der H-57-Antikörper so stark verdünnt, dass er die Turf-M-Bildgebung nicht mehr stört, gleichzeitig aber die Sättigung des T-Zell-Rezeptors aufrechterhalten bleibt, während das ursprünglich gebundene Fab zu dissociieren beginnt, und geben sie danach in die Durchflusszelle ein.

Wir stellen die immunologische Synapse im Dreifarbenturf-M-Modus dar. Dazu gehört die Bildung der LFA-1–ICAM-1-Interaktion, die Bildung von TCR-Clustern und dem C-smac sowie die anhaltende Bildung von TCR-Mikroclustern, die GFP-ZAP-70 rekrutieren. Einige dieser Ergebnisse sind bereits während der Aufnahme erkennbar, während andere einer nachträglichen Analyse bedürfen, um sie vollständig zu erfassen.

Okay, wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man unterstützte planare Doppelschichten verwendet, um die immunologische Synapse zu untersuchen. Damit diese Experimente funktionieren, ist es sehr wichtig, dass sich die T-Zellen in sehr gutem Zustand befinden, und dass die PPS-Pufferlösung nicht für die Langzeitkultur von T-Zellen geeignet ist. Sie sollten die Zellen daher aus der Kultur entnehmen, in dieses Medium überführen und anschließend sehr zügig verwenden.

Wenn Sie länger dauernde Experimente durchführen möchten, gibt es einige sehr gute serumfreie Kulturmedienformulierungen, die Sie anstelle der he-Stück gepufferten Salzlösung verwenden können. Diese halten die Zellen wesentlich länger am Leben, falls Sie längere Endpunkte untersuchen möchten, wie beispielsweise die Zytokinproduktion oder die Proliferation der T-Zellen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.