Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Hallo, ich bin Mike Dustin vom Geral Institute und der New York University School of Medicine. Heute führe ich Sie durch das Verfahren der Bildung eines unterstützenden planaren Biolays zur Untersuchung der immunologischen Synapse. Also lasst uns loslegen.

Um die Lipiddoppelschicht herzustellen, bereiten wir eine Lösung aus 20 % Nickel, chelatbildendem Lipid und 80 % Phosphatidylcholin in den entsprechenden Mengen in einem Glasröhrchen mit ein bis zwei Millilitern Chloroformmethanol vor. Der erste Schritt besteht darin, das Lösungsmittel unter einem Strom von Stickstoffgas in einem warmen, 30 bis 37 Grad Celsius warmen Wasserbad zu verdampfen. Dies dauert in der Regel etwa 15 Minuten.

Entfernen Sie dann alle Lösungsmittelreste unter Hochvakuum mit einem Gefriertrockner für 90 Minuten. Als nächstes lösen Sie die Lipide in 2%N oktalem Glukozid-Detergens-Zins-Kochsalzpuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 Millimolar. Dadurch entsteht eine Lösung aus gemischten Phospholipid-Myzellen des Detergens, um Liposomen zu bilden.

Sie dialysieren diese Lösung gegen drei Wechsel von Tris-Kochsalzlösung, um das Waschmittel zu entfernen und Liposomen zu bilden. Wir arbeiten in der Regel mit Volumina in der Größenordnung von einem Milliliter bei Rohren mit einem Durchmesser von sechs Millimetern mit einem Cutoff von etwa 10 Kilodalton und achten darauf, dass beim Einklemmen der Schläuche keine Luftblasen entstehen. Wir filtern diese Lösung steril und führen die Dialyse unter sauberen Bedingungen durch und handhaben sie mit 70% Ethanol-sterilisierten Handschuhen.

Diese Lösung sollte kristallklar sein und wird unter Argonnengas gelagert, um eine Oxidation zu verhindern. Wenn die Lösung trüb ist, haben Sie mehrwandige Vesikel erzeugt und müssen erneut beginnen. Um das Experiment durchzuführen, müssen wir zunächst bestimmen, wie viel ICAM on und MHC auf einer gegebenen Oberfläche der Nickelchelat-Doppelschicht bei einer bestimmten Konzentration an löslichem Protein abgelagert werden.

Dazu scheiden wir Doppelschichten auf Glasgeschwindigkeiten mit einem Durchmesser von fünf Mikrometern ab. Inkubieren Sie die Glaskügelchen mit Proteinlösungen unter Bedingungen, die denen in den für die Bildgebung verwendeten Flusszellen entsprechen, und lesen Sie dann die Dichte des gebundenen Proteins durch einen molekular-fluormetrischen Flow-Immuno-Fluoro-Assay aus. FSI-markierte Antikörper mit bekannter Anzahl von Fluorescein pro Molekül werden zum Nachweis der oberflächengebundenen Proteine verwendet, und Fluorescein-Standardkügelchen werden zur Kalibrierung des Durchfluss-Mikrofluorimeters verwendet.

Wir werden Bedingungen schaffen, die denen auf antigenpräsentierenden Zellen mit 200 Molekülen pro Quadratmikrometer von ICAM eins und 0,2 bis 20 Molekülen pro Quadrat entsprechen. Mikrometer von I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, komplexe planare Doppelschichten bilden sich spontan, wenn die Liposomen mit Glas verschmelzen, aber nur, wenn es richtig gereinigt wird, um Glas zu reinigen. Wir verwenden saure Piana-Lösung, eine frisch zubereitete Mischung aus Schwefelsäure und 30%igem Wasserstoffperoxid, die jegliches organische Material zerstört und die Glasoberfläche sehr hydrophil macht.

Bei der Arbeit mit Piranhas tragen wir vollständige Schutzkleidung, einschließlich einer Säureschürze und schweren, säurebeständigen Stulpenhandschuhen. Der Abfall muss sorgfältig von den organischen Abfällen getrennt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Zur Herstellung der sauren Piranha-Lösung 75 Milliliter konzentrierte Schwefelsäure in ein trockenes Becherglas geben und dann vorsichtig 25 Milliliter 30%iges Wasserstoffperoxid hinzufügen.

Die Lösung erhitzt sich schnell auf mehr als 100 Grad Celsius und taucht dann die trockenen Deckgläser 15 Minuten lang in die Lösung. Nach dieser Inkubation in Piranhas tauchen Sie die Deckgläser in gereinigtes Wasser und spülen Sie sie dann eine Minute lang auf jeder Seite aus. Trocknen Sie dann die Deckgläser mit einer Vakuumquelle, um das gereinigte Wasser abzulassen.

Lassen Sie die Piranha-Lösung abkühlen und geben Sie sie in den Piranha-Abfallbehälter, der mit einer losen Kappe belassen wird, die gut im Abzug markiert ist, um die Doppelschichten zu bilden. Unser Labor verwendet bi FCS zwei Kammern, die die Vorteile einer integrierten Heizung haben. Das FCS two-System befindet sich auf einem Edelstahlsockel, der einen mikrofluidischen Verteiler mit einer 0,5 Millimeter dicken oberen Dichtung, einen mit Indiumzinnoxid beschichteten Mikroaquäduktschieber zur Erwärmung auf der einen Oberfläche und eine fluidische Nut auf der anderen Seite zusammenklemmt.

Eine staubfreie 0,25-Millimeter-Dichtung, die die Höhe der Strömungskammer definiert, und der Piranha-gereinigte 40 Millimeter runde Deckglas, auf dem die Doppelschicht gebildet wird, um die Durchflusszelle zusammenzubauen und planare Doppelschichten zu bilden. Stellen Sie den Verteiler mit den Rohren nach oben auf eine ebene Fläche. Platzieren Sie dann die 0,5-Millimeter-Dichtung mit Löchern über den Fluidikrohren und stellen Sie sicher, dass diese flach sitzt.

Platzieren Sie den Mikro-Aquädukt-Objektträger vorsichtig mit den Fluidikkanälen nach oben und stellen Sie sicher, dass er flach sitzt, ohne Druck nach unten auszuüben, bis Sie überprüft haben, dass die Löcher im Objektträger die Mikrofluidik-Schläuche ausrichten. Legen Sie dann die staubfreie 0,25-Millimeter-Dichtung mit einem rechteckigen Ausschnitt auf den Mikro-Aquädukt-Objektträger, so dass der Kanal mit den Fluidikkanälen ausgerichtet ist und es keine großen Lufträume gibt. Platzieren Sie bis zu fünf Ein-Mikroliter-Tropfen Liposomensuspension auf der Oberfläche des Mikro-Aquädukt-Objektträgers in einem Muster, so dass der Abstand zwischen Zentrum und Zentrum zwischen jedem Tropfen 2,5 Millimeter beträgt. Die fünf Liposomentropfen können unterschiedliche Zusammensetzungen haben, aber in diesem Fall bilden wir nur zwei Doppelschichten, eine ohne Nickelchelatlipide und eine mit 10% Nickelchelatlipiden.

Sobald diese Tropfen an Ort und Stelle sind, legen Sie den Deckel vorsichtig in einer Bewegung auf die Oberfläche und klemmen Sie ihn so schnell wie möglich auf die Basis. Die Liposomentropfen sollten mit dem Deckglas in Berührung kommen. Dieser Kontakt sollte nicht unterbrochen werden, da sich die Doppelschichten wahrscheinlich bereits gebildet haben und eventuelle Unterbrechungen zu defekten Doppelschichten führen können.

An dieser Stelle ist es wichtig, daran zu denken, die Positionen der Doppelschichten mit ein paar kleinen Tintenflecken auf dem Objektträger zu markieren, um die Positionierung des Deckglases auf dem Mikroskop zu erleichtern. Warten Sie 20 Minuten, um sicherzustellen, dass das System äquilibriert ist, und übertragen Sie alle Lösungen mit einer 20-Milliliter-Spritze, die mit einem etwa 20 Zentimeter langen flexiblen Schlauch verbunden ist, und einem Dreiwege-Absperrhahn. Ein weiterer Anschluss des Absperrhahns wird dann durch ein kurzes Schlauchstück mit der Durchflusszelle verbunden, um das Totvolumen zwischen dem Absperrhahn und der Durchflusszelle zu minimieren.

Füllen Sie die Spritze mit heis gepufferter Kochsalzlösung, die Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Glukose und Humanserumalbumin enthält. Grundieren Sie den Schlauch und den Absperrhahn, so dass keine Luftblasen entstehen. Verbinden Sie diese dann mit den Durchflusszellen und drücken Sie fünf Milliliter in einer Bewegung durch, während Sie darauf achten, dass keine Luftblasen über die Doppelschicht gelangen.

Jetzt hast du deine Doppelschichten, um die mit Zischen markierten Proteine in die Doppelschicht einzuführen. Er muss zuerst mit Kasen verschlossen und mit Nickel beladen werden. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Casen-Nickel-Ionen-Lösung und verbinden Sie diese mit dem seitlichen Port, ohne dass Luftblasen eingeschlossen werden.

Warten Sie nach der Injektion der Lösung 20 Minuten, um eine vollständige Blockierung zu ermöglichen. Waschen Sie dann die Blockierlösung mit H-B-S-H-S-A aus der 20-Milliliter-Spritze aus. Injizieren Sie nun 0,5 Milliliter H-B-S-H-S-A-Lösung, die die Polyhis-markierten ICAM one und IEK enthält.

In diesem Experiment wird der ICAM mit SCI fünf gekennzeichnet. Die Wechselwirkungen zwischen LFA und ICAM können also verfolgt werden, indem die ICAM eine Umlagerung in der Doppelschicht abgebildet wird: Lassen Sie das Protein 30 Minuten lang an die mit Nickel geladene Doppelschicht binden, während das Protein an der Doppelschicht haftet. Befestigen Sie die Durchflusszelle mit einem speziellen Tischeinsatz am inversen Mikroskop.

Schließen Sie dann die Heizelektronik an, damit das System bei 37 Grad Celsius ausgeglichen werden kann. Verwenden Sie die zuvor vorgenommenen Markierungen, um die Durchflusszelle so zu positionieren, dass das Objektiv mit einer der Doppelschichten ausgerichtet ist, und verwenden Sie die Interferenzreflexionsmikroskopie, um die Fokusebene zu lokalisieren, indem Sie sich auf das reflektierte Lichtbild der Feldblende konzentrieren. Zum Schluss waschen Sie das ungebundene ICAM aus den Durchflusszellen aus.

Erfassen Sie Fluoreszenzbilder der Doppelschicht im ICAM-Einkanal im Turf-M- und Weitfeldmodus. Dies dient dazu, die Bindung von ICAM one an die nickelbeschichtete Doppelschicht relativ zur nickelfreien Doppelschicht zu bestätigen. Die Durchflusszelle ist nun bereit für die Aufnahme von Zellen.

Für diese Demonstration werden wir einen ND-T-Zell-Rezeptor transgene T-Zellen verwenden, die mit einer Retrovirus-ENC-Beschichtung GFPs P zap 70 transduziert wurden, die Zellen einmal mit H-B-S-H-S-A waschen und dann die Zellen mit einem Alexa 5 68-markierten FAB zum T-Zell-Rezeptor inkubieren, damit wir die TCR-Mikrocluster verfolgen können. Nach 15 Minuten verdünnen Sie die Zellen um eins bis 10. Dadurch wird der H-57-Antikörper so verdünnt, dass er die Rasen-M-Bildgebung nicht beeinträchtigt, aber die Sättigung des T-Zell-Rezeptors aufrechterhält, wenn die ursprünglich gebundene Fab zu dissoziieren beginnt und sie dann in die Durchflusszelle injiziert.

Wir bilden die immunologische Synapse im dreifarbigen Turf-M-Modus ab. Dies beinhaltet die Bildung der Interaktion LFA one, ICAM one, die Bildung von TCR-Clustern und des C smac sowie die nachhaltige Bildung von TCR-Mikroclustern, die GFP ZAP 70 rekrutieren. Einige dieser Ergebnisse sind während der Erfassung offensichtlich, während andere eine Nachbearbeitungsanalyse erfordern, um sie vollständig zu würdigen.

Okay, wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie gestützte planare Doppelschichten verwenden können, um die immunologische Synapse zu untersuchen. Für diese Experimente ist es sehr wichtig, dass die T-Zellen in sehr gutem Zustand sind und die PPS-gepufferte Kochsalzlösung nicht sehr gut für die Langzeit-T-Zellkultur geeignet ist. Man möchte also die Zellen aus der Kultur nehmen, sie in dieses Medium stecken und sie dann sehr schnell verwenden.

Wenn Sie feststellen, dass Sie längerfristige Experimente durchführen möchten, gibt es einige sehr gute serumfreie Medienformulierungen, die Sie durch die gepufferte Kochsalzlösung ersetzen können. Das hält die Zellen viel länger am Leben, wenn Sie einen längeren Endpunkt wie die Zytokinproduktion oder die Proliferation der T-Zellen durchführen möchten. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.