Name: Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Lernen Sie die Herstellung unterstützter Planar-Bilayer zur Untersuchung immunologischer Synapsen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung molekularer Interaktionen mittels TIRF-Mikroskopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Vorbereitung der Lipide <ol><li> Um Proteine ​​an die obere Flugblatt einer Doppelschicht Link verwenden wir Ni 2 + Komplexbildner Lipide, die rekombinante Proteine ​​mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Bestimmte Zelltypen können nicht speziell an Ni 2 +-beschichtete Doppelschichten, aber T-Zellen in der Regel nicht, so dass diese Methode optimal für das Studium T-Zell-Aktivierung. </li><li> Die Lipid-Doppelschicht-Lösung wird durch Herstellen einer Lösung von 20% Ni 2 + gemacht chelatisierenden Lipid-und 80% Phosphatidylcholin in die entsprechenden Beträge in ein Glasrohr mit 1-2 ml Chloroform-Methanol. <ol><li> Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von Stickstoffgas in einem warmen (30-37 ° C) Wasserbad. Dies dauert in der Regel etwa 15 Minuten. </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittels im Hochvakuum mit einem Lyophilisator für 90 Minuten. </li></ol></li><li> Lösen Sie die Lipide in 2% N-Octyl-Glucosid Reinigungsmittel in Tris-Saline-Puffer, der eine Lösung von gemischt Waschmittel / Phospholipid-Micellen erzeugt. Die endgültige Phospholipidkonzentration sollte 0,4 mm betragen. Zur Bildung Liposomen, dialysieren diese Lösung gegen 3 Änderungen der Tris-Saline zu Wasch-und Form-Liposomen zu entfernen. Wir in der Regel mit einem Volumen Arbeit in der Größenordnung von 1 ml mit 6 mm Durchmesser Spectra / Por # 2 Schläuche mit einem Cut-off um 10 kDa. Wir sind darauf bedacht, jede Luftblase s auszuschließen beim Spannen des Rohres. Wir in der Regel steril-Filter diese Lösung und nicht die Dialyse unter sauberen Bedingungen, die Handhabung ist mit 70% Ethanol sterilisiert Handschuhe. </li><li> Diese Lösung sollte klar sein. Es wird unter Argon-Gas, um Oxidation zu verhindern gespeichert. Wenn die Lösung trüb, dann mehrwandigen Bläschen erzeugt worden sind, und Sie müssen wieder von vorne anfangen. </li></ol> 2. Ermitteln, wie viel ICAM-1 und MHC auf der planaren Bilayer abgelagert werden <ol><li> Um das Experiment, ist es zunächst notwendig, um festzustellen, wie viel ICAM-1 und MHC auf einer gegebenen Fläche von Ni 2 + Chelat-Doppelschicht sind bei einer gegebenen Konzentration an löslichem Protein abgelagert. Um dies zu tun, Kaution Doppelschichten auf 5 Mikrometer Durchmesser Glasperlen, inkubieren Sie die Glasperlen mit Proteinlösungen unter Bedingungen, die annähernd denen in den Fluss-Zellen für die Bildgebung verwendet wird, und liest die Dichte des gebundenen Proteins durch eine Strömung immunofluorometric Assay. </li><li> FITC-markierten Antikörpern mit bekannten Zahlen von Fluorescein pro Molekül verwendet, um die Oberflächen-gebundenen Proteine ​​nachzuweisen. Fluorescein-Standard Kügelchen verwendet werden, um den Fluss microfluorimeter kalibrieren. </li><li> Wir schaffen Bedingungen, die annähernd denen von Antigen-präsentierenden Zellen mit 200 molecules/μm2 von ICAM-1 und 0,2-20 molecules/μm2 der I-Ek-MCC91-103-Komplex. </li></ol> 3. Reinigung der Glasdeckgläschen zur Bildung planarer Doppelschichten <ol><li> Planar Lipid-Doppelschichten bilden sich spontan, wenn die Liposomen Glaskolbensicherung, aber nur, wenn das Glas richtig gereinigt. </li><li> Bei der Arbeit mit Piranha, tragen wir die volle Schutzkleidung, einschließlich einer Säure Schürze und schwer, säurebeständigen Handschuhen. Sorgfältig trennen die Abfälle aus organischen Abfällen und ordnungsgemäß entsorgen. </li><li> Zur Vorbereitung der Säure Piranha-Lösung, 75 ml konzentrierte Schwefelsäure auf ein trockenes Becherglas und fügt vorsichtig 25 ml 30% iges Wasserstoffperoxid. Die Lösung schnell erwärmt sich auf mehr als 100 ° C. </li><li> Tauchen Sie den trockenen Deckgläser in die Lösung für 15 Minuten. Entfernen Sie aus der Lösung und spülen Sie in gereinigtem Wasser für eine Minute auf jeder Seite. Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Vakuum-Quelle zur Ableitung des gereinigten Wassers. Lassen Sie das Piranha-Lösung zu kühlen, und fügen Sie den Piranha Abfallbehälter, die mit der Kappe lose, auch im Abzug markiert links ist. Wenn alle der Liposomen, Deckgläser und Proteine ​​hergestellt werden, ist der immunologischen Synapse bereit, gebildet werden. </li></ol> 4. Die Ausbildung der Doppelschichten <ol><li> Zur Ausbildung der Doppelschichten, nutzt unser Labor Bioptechs FCSII Kammern, die die Vorteile der integrierten Heizung haben. Die FCSII System basiert auf einem Sockel aus Edelstahl, die Bügelhälften einem mikrofluidischen Verteiler mit einer 0,5 mm Top-Dichtung, ein microaqueduct Rutsche mit Indium-Zinn-Oxid für die Heizung auf einer Oberfläche beschichtet, mit fluidischen Nut auf der anderen Seite, eine staubfreie 0,25 mm Dichtung, dass die Höhe der Flusskammer und der Piranha definiert gereinigt 40 mm runden Deckglas, auf denen die Doppelschicht gebildet wird. </li><li> Während das Deckglas, auf denen die Doppelschicht gebildet wird, muss stark hydrophil und sauber, die microacqueduct schieben tatsächlich funktioniert besser, wenn es mehr hydrophoben ist. Making the microaqueduct mehr hydrophobe durch Behandlung mit 1% HSA 60 Minuten bei Raumtemperatur erreicht wird, dann Waschen mit reinem Wasser und Trocknen vollständig nach dieser Konditionierung, sowie zwischen den Anwendungen. Die Beschichtung von denaturierten Proteinen durch dieses Verfahren verlassen können 1 ul Liposomensuspension zu einer Runde hemisphaerica Forml Tropfen,&gt; 0,25 mm hoch ist. </li><li> Um die Durchflusszelle und bilden planare Doppelschichten montieren, stellen die vielfältigen, mit den Rohren nach oben gerichtet, auf eine ebene Fläche. Legen Sie dann die 0. 5 mm Dichtung mit Löchern in den fluidischen Röhren positioniert, um sicherzustellen, dass es sitzt flach. Sanft legen Sie die microaqueduct Seite auf die Dichtung mit dem fluidischen Kanäle nach oben und stellen Sie sicher, es Sitze ohne jeglichen Druck nach unten flach, bis die Überprüfung, dass die Löcher in die Folie mit dem mikrofluidischen Rohre auszurichten. Legen Sie die staubfreie 0,25 mm Dichtung mit einem rechteckigen Ausschnitt auf der Oberseite des microaqueduct schieben, so dass die Kanal mit dem fluidischen Kanälen gesäumt und es gibt keine größeren Lufträumen. </li><li> Legen Sie bis zu 5 x 1 ul Tropfen Liposomensuspension auf der Oberfläche des microaqueduct Folie in ein Muster, so dass die Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den einzelnen Tropfen 2,5 mm ist. Die 5 Liposomen Tropfen können unterschiedliche Zusammensetzungen haben, aber in diesem Fall werden wir nur bilden zwei Doppelschichten, eine ohne Ni 2 + + Komplexbildner Lipide und eine mit 10% Ni 2 + + Komplexbildner Lipiden. </li><li> Sobald diese Tropfen vorhanden sind, vorsichtig den Deckel nach unten rutschen auf der Oberfläche in einer Bewegung. Clamp auf den Boden so schnell wie möglich. Das Liposom Tropfen sollten Kontakt mit dem Deckglas zu machen. Dieser Kontakt sollte nicht gebrochen werden, da die Doppelschichten wahrscheinlich schon gebildet haben; etwaige Störungen können in defekten Doppelschichten führen. </li><li> Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, um die Positionen der Doppelschichten mit ein paar kleinen Tinte Flecken auf der microacqueduct Folie Positionierung des Deckglas unter dem Mikroskop Hilfe zu markieren. Warten Sie 20 Minuten, um sicherzustellen, hat das System äquilibriert. Übertragen Sie alle Lösungen mit einer 20 ml Spritze verbunden, über 20 cm Schlauch und einem 3-Wege-Hahn. Schließen Sie einen anderen Port des Hahnes auf die Messzelle mit einem kurzen Rohrstück das Totvolumen zwischen dem Hahn und der Durchflusszelle zu minimieren. Füllen Sie die Spritze mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung mit 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 1% humanem Serumalbumin. </li><li> Prime den Schlauch und Hahn so gibt es keine Luftblasen. Schließen Sie hier die Messzellen und durchzusetzen 5 ml in einer Bewegung, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen in den Doppelschicht passieren. Jetzt haben Sie Ihre Doppelschichten. </li></ol> Dieses Video Artikel unterstützt &quot;Hunter Gatherer und zurück: immunologischen Synapsen und Kinapses als Variationen über das Thema der amöboiden Locomotion&quot; von <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Annual Review of Cell and Developmental Biology</a> , Band 24, 2008.

unterstützte planar-membranen für die bildung von study of immunologischen synapsen und kinapse

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Zur Simulation der Wechselwirkungen zwischen Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen, verwenden wir Ni2 +-Chelat-Lipide zur rekombinanten Zell-Adhäsion und MHC-Proteine ​​an der oberen Flugblatt einer Doppelschicht mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Planar-Doppelschichten sind durch die Vorbereitung Lipid, die Behandlung der Glasflächen, wo der Doppelschicht bilden, und dann bildet der Doppelschicht in einer spezialisierten Kammer mit einem Flow-Zelle, wo die Lymphozyten hinzugefügt werden generiert. Dann Doppelschichten sind mit Ni-und His-markierten rekombinanten Proteinen berechnet werden hinzugefügt. Schließlich Lymphozyten sind in die Messzelle und TIRF-Mikroskopie injiziert werden, um Bild Synapsenbildung und die Mechanismen genutzt werden, dass die Kontrolle T-Zell-Lokomotion, Websites von Rezeptor-Sortierung und Websites von Rezeptor-Abbau.

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Unterstützte planare Bilayern sind leistungsstarke Werkzeuge, die zur Modellierung molekularer Interaktionen in einer immunologischen Synapse eingesetzt werden können. Um die Interaktionen nachzubilden ...

Hallo, ich bin Mike Dustin vom Geral Institute und der medizinischen Fakultät der New York University. Heute werde ich Sie durch das Verfahren zur Herstellung unterstützender planarer Biolays zur Untersuchung der immunologischen Synapse führen. Beginnen wir also.Um den Lipiddoppelschicht herzustellen, bereiten wir eine Lösung aus 20 % Nickel-chelatisierendem Lipid und 80 % Phosphatidylcholin in geeigneten Mengen in einem Glasröhrchen mit ein bis zwei Millilitern Chloroform-Methanol vor. Der erste Schritt besteht darin, das Lösungsmittel unter einem Strom von Stickstoffgas in einem warmen Wasserbad von 30 bis 37 Grad Celsius zu verdampfen. Dies dauert gewöhnlich etwa 15 Minuten.Entfernen Sie anschließend unter Vakuum jeglichen verbleibenden Lösungsmittel mithilfe eines Lyophilisators für 90 Minuten. Lösen Sie danach die Lipide in einem Puffer aus 2 % Octylglucosid in physiologischer Kochsalzlösung, um eine Endkonzentration von 0,4 Millimolar zu erreichen. Dadurch entsteht eine Lösung gemischter Detergens-Phospholipid-Mizellen zur Bildung von Liposomen.Sie dialysieren diese Lösung gegen drei Wechsel von Tris-Salzlösung, um das Tensid zu entfernen und Liposomen zu bilden. Üblicherweis

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Visualisierung der Bildung der immunologischen Synapse in natürlichen Killerzellen (NK) auf einer gestützten Lipiddoppelschicht (SLB). Der SLB wird zunächst mit einem Fluorophor-markierten NK-Zell-aktivierenden Rezeptorliganden markiert, gefolgt von der Inkubation mit NK-Zellen. Anschließend werden die Zellen mit polymerisiertem Aktin und Perforin-positiven lytischen Granulaten angefärbt. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Synapsenbildung...

Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Untersuchung der Immunsynapsenbildung zwischen primären menschlichen T-Zellen und gestützten Lipiddoppelschichten (SLB). T-Zell-Oberflächenproteine interagieren mit den jeweiligen Liganden, die auf SLB immobilisiert sind, um eine Immunsynapse zu bilden, gefolgt von der Bewegung der lytischen Granula in Richtung der Synapse, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wird.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der T-Zell-Interaktion mit gestützten planaren Lipid-Doppelschichten

Dieses Video zeigt die Bildgebung von lebenden Zellen der immunologischen Synapsentopologie und untersucht die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und Epithelzellen, die fluoreszierende Antigene tragen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine rote Zytoplasma-Verschiebung und gelbe Membranringe in Endothelzellen, was auf die Bildung immunologischer Synapsen hinweist.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Die adaptive Immunität wird durch dynamische 'immunologische Synapsen' gesteuert, die zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen gebildet werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von Endothelzellen sowohl als wenig untersuchte physiologische APCs als auch als eine neuartige Art von "planarem zellulärem APC-Modell".

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

Hier stellen wir das Protokoll für die schrittweise Rekonstitution synthetischer Antigen-präsentierender Zellen unter Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers und deren Verwendung zur Abfrage der synaptischen Ausgabe von aktivierten T-Zellen vor.

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt...

Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Lernen Sie die Herstellung unterstützter Planar-Bilayer zur Untersuchung immunologischer Synapsen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung molekularer Interaktionen mittels TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Weitere Videos entdecken