Summary
En teknik presenteras för in-vivo samling av interstitiell vätska prover från relevanta vävnad platser (här, experimentellt inflammerad hud) för mätning av biokemiska förmedla smärta och inflammation.
Abstract
Detta in vivo mänskliga bioassay kan användas för att studera frivilliga försökspersoner och patienter. Prover samlas in från relevanta vävnad platser som huden via aseptiskt in mikrodialys katetrar (Dermal dialys, Erlangen, Tyskland). Illustrerad i detta exempel är insamling av interstitiell vätska från experimentellt inflammerad hud på frivilliga försökspersoner. Provtagning kan kombineras med andra experimentella tester. Till exempel ger en samtidig bedömning av lokalt släppt biokemikalier och subjektiv känslighet för smärtsamma stimuli i experimentellt inflammerad hud den kritiska biokemiska beteendeterapi länk för att identifiera biomarkörer för smärta och inflammation. Presenteras analysen i den levande mänskliga organismen tillåter mekanistiska inblick i vävnadsspecifika processer som ligger bakom smärta och / eller inflammation. Metoden är också väl lämpad för att undersöka effektiviteten av befintliga eller nya åtgärder - till exempel nya läkemedelskandidater - med inriktning på behandling av smärtsamma och / eller inflammatoriska tillstånd. Denna artikel kommer att ge en detaljerad beskrivning om användningen av mikrodialys tekniker för att samla in interstitiell vätska från experimentellt inflammerad hud lesion av mänskliga försökspersoner. Interstitiell vätska prover är oftast behandlas med hjälp av multiplex pärla rad immunologiska låta testmetoder för upp till 100 analyter i prover så små i volym som 50 mikroliter.
Protocol
Induktion av experimentell inflammation:
- En första gradens solbränna induceras i icke-solbränd hud av ett lår med hjälp av en kalibrerad, ultraviolett B-källa (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Tyskland). Den solbränna induceras 24 timmar innan en mikrodialys experiment genom att tre gånger så mycket UVB-ljus krävs för att orsaka fullständig rodnad av exponerad hud, eller tre gånger den minimala erytemdos (MED). MED bestäms i varje ämne innan studiens start. Exakt leverans av energi är säkrad med en UV-mätare (RM 12, Dr Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Tyskland).
Kateter placering och provtagning:
- Förbered en mellanstation område med sterila handskar, en steril nål, 1 ml luerfattningen spruta med en 23 gauge (G) nål, 1 ml spruta med en 30G nål, 1% lidokain, spritkompresser, 2x2 steril gasbinda kuddar, mikrodialys katetrar fastsatta i ena änden till en 4cm 23G nål (Dermal dialys, Erlangen, Tyskland) och 1,5 ml Microcent rör samlingen (E & K Vetenskapliga, Santa Clara, CA.) med 4μl proteashämmare lösning per 100μl prov på torr is. proteashämmare lösning gjorts enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av proteashämmare tabletter hämmare cocktail (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland).
- Bered en 1% humant albumin lösning i Ringer-laktat lösning och dra in den i 1 ml luerfattningen spruta, vilket gör att det inte finns några luftbubblor kvar i sprutan.
- Ladda sprutan med 1% humant albumin-berikade Ringer-laktatlösning i vaggan (mikrodialys multi-spruta rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) monteras på en hög precision infusionspump (pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Se till att baren av infusionspump kör sprutan är i full kontakt med sprutkolven. Ställ in pumpens hastighet efter att ha bekräftat att sprutan diameter exakt har matats in i pumpen. Vanligen används infusion varierar mellan 2 till 4μl/min.
- Definiera området du planerar att samla in ditt prov från. Vid provtagning från ett konstlat inflammerade området, till exempel solbränna beskrivits ovan, planerar att sätta in kateter i kanten av solbränna.
- Rengör ett litet område på motsatta kanter av lesionen eller webbplats du vill hämta ditt prov från, med alkohol. Dessa rengjorda områden kommer att vara den avsedda insättning och uttagspunkter för katetern. Spruta bara tillräckligt lidokain inom kutant (framgår av blekning av huden på injektionsstället) på dessa platser för att skapa en mycket liten blåsa (max 2mm). Injektion av sådan begränsad mängd inom kutan lidokain vid in-och utförsel av mikrodialys kateter bör inte förändra resultaten från det biologiska testet, men gör införandet av katetern betydligt mindre smärtsam för försökspersoner.
- Med aseptisk teknik, sätt in mikrodialys katetrar med hjälp av bifogade 23G nål över längd utforskade huden. Djupet för insättning är i gränssnittet mellan cutis och underhuden. Insättning på tillräckligt djup kan kontrolleras optiskt. Eftersom nålen och fäst katetern flyttas framåt nålen skulle orsaka lite upp-vikning av huden samt några blekning av huden. Inga blödningar skulle inträffa. Om blödningen inträffar detta tyder på att nålen ligger djupare än avsett och djup insättning måste justeras. När nålen har drivit igenom utförselstället av huden, spola katetrar med 1% albumin berikat Ringer-laktatlösning tills du ser droppar längs katetern. Detta görs genom att försiktigt föra in nålen i slutet av en spruta (23G nål) i den distala änden av mikrodialys kateter, och långsamt injicera lösningen.
- Efter spolning av katetern dra försiktigt nålen för att mata den bifogade kateter genom huden. Skonsam hantering är nödvändig eftersom de katetrar är klena, och därmed sköra. Dra katetern tills den är helt träs genom huden, berör dvs basen av de större plaströr bädda den distala änden av katetern huden vid inkörsporten. Som nämnts ovan, bekräftar liten eller ingen blödning i slutet av förfarandet optimala katetern placering.
- Anslut den distala änden av katetern till toppen av 23G nålen på sprutan vilar i racket av infusionspump. Försiktighet krävs för att undvika punktering nålen genom väggen av katetern, vilket skulle medföra möjliga läckage.
- Skär av kanylen från den proximala änden av katetern.
- Använda ¼-tums rosa band, fäster den förberedda 1,5 ml Microcent samling rör vid huden nära avfarten platsen av katetern. Placera spetsen av katetern i provröret för att möjliggöra insamling av microdialysate. Starta perfusion pumpen vid förutbestämda råt och periodvis kontrollera att levereras och uppsamlade volymen matcha upp. I de fall volymerna inte matchar upp, läckage från huden posten webbplats bör uteslutas (kan ibland lösas genom att dra den del av katetern som är inbäddat i plastslang hårdare på huden posten webbplats). Alternativt kan en kateter behöver bytas om det levereras och samlade volymerna inte stämmer.
- När provtagningen är klar, är proverna placeras på torr is tills förvaring vid -80 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kombinerade användningen av mikrodialys teknik och multiplex RIA-teknik är en värdefull realtid in vivo mänskliga bioassay som ger inblick i biokemiska händelser i vävnad av intresse. Kombinerat med beteendevetenskaplig tester såsom smärta tester tillåter metoden att studera de komplexa sambanden i biokemikalier förmedla smärta och inflammation. Metoden är lovande för 1) att identifiera vävnaden specifika biomarkörer förmedla smärta och inflammation, 2) ge mekanistisk insikt i patologi inflammatoriska och kroniska smärttillstånd med perifer vävnad patologi, och 3) att utforska smärtstillande / anti-hyperalgesic och antiinflammatoriska åtgärder nya läkemedelskandidater och interventionella behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
