A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.
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Artículo de método
Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
En este video, se describen los métodos electrofisiológicos para la grabación de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular (UNM) de larvas de Drosophila. La larva sistema neuromuscular es una sinapsis modelo para el estudio de la fisiología sináptica y la neurotransmisión, y es una valiosa herramienta de investigación que ha definido la genética y es accesible a la manipulación experimental. Las larvas pueden ser diseccionados para exponer la pared del cuerpo musculatura, el sistema nervioso central, y los nervios periféricos. Los músculos de Drosophila y su patrón de inervación están bien caracterizados y los músculos son de fácil acceso para el registro intracelular. Los músculos individuales pueden ser identificados por su ubicación y orientación dentro de los 8 segmentos abdominales, cada una con 30 músculos dispuestos en un patrón que se repite en los segmentos A2 - A7. Disecados larvas de Drosophila son músculos delgados y el individuo y los haces de axones de neuronas motoras pueden ser visualizados por transiluminación
Protocolo
Antes de comenzar preparar:
- Vagando yhird instar las larvas de Drosophila
- HL3.1 (Modificado hemolinfa-como) una solución
- Sylgard (caucho de silicona transparente) platos preparados en la disección pequeño (35 x 10 mm) placas petri de plástico con los métodos descritos por Brent y McCabe (2008) 3.
- Cortar pernos disección corta
- Estimular pipetas electrodo
- Pipetas afiladas grabación
HL3 Solución:
- Durante las disecciones y experimentos electrofisiológicos, larva se encuentran inmersos en HL3.1 solución 2 que contiene (en mM): NaCl 70, 5 KCl, 4 ....
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Discusión
Los métodos descritos aquí proporcionan una manera relativamente rápida y amplia para detectar los cambios en la función sináptica en la UNM. La capacidad de realizar los registros electrofisiológicos con animales intactos in vivo, y llevar a cabo manipulaciones genéticas o farmacológicas, que Drosophila un modelo animal ideal para investigar los aspectos fisiológicos y genéticos de la neurotransmisión.
Dado que las células musculares son muy grandes, otros prefieren agregar un paso adiciona.......
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri pequeñas (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| Kit de elastómero de silicona SYLGARD 182 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Microscopio de disección | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Luz para microscopio | Schott AG | KLI500 | |
| Alfileres de disección | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Software pClamp 9 | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Tijeras de disección: tijeras de resorte Vannas de 3 mm | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Pinzas Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinzas Dumont n.º 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capilares de vidrio borosilicatado de pared delgada, con filamento (1,0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Capilares de vidrio borosilicatado, con filamento (1,2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Extractor de micropipetas basado en láser Sutter P-2000 | Sutter Instrument Co. | Modelo P-2000 | |
| Pulidora de pipetas | Narishige International | MF-83 | |
| Etapa de cabeza Axon HS-2A | Molecular Devices | Modelo HS-2A | |
| Micromanipuladores | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Amplificador Axoclamp 2B | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Software Clampex | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Software Mini analysis, v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Amplificador de precisión Brownlee | Brownlee | Modelo 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sacarosa | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Generador de pulsos Master-8 | A.M.P.I | ||
| Mesa vibratoria para configuración de electrofisiología | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Jaula de Faraday |
Referencias
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F.
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Reimpresiones y permisos
