$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Antes de comenzar preparar:
- Vagando yhird instar las larvas de Drosophila
- HL3.1 (Modificado hemolinfa-como) una solución
- Sylgard (caucho de silicona transparente) platos preparados en la disección pequeño (35 x 10 mm) placas petri de plástico con los métodos descritos por Brent y McCabe (2008) 3.
- Cortar pernos disección corta
- Estimular pipetas electrodo
- Pipetas afiladas grabación
HL3 Solución:
- Durante las disecciones y experimentos electrofisiológicos, larva se encuentran inmersos en HL3.1 solución 2 que contiene (en mM): NaCl 70, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalosa, sacarosa 115, y HEPES 5, pH 7,2.
- Las concentraciones de CaCl 2 se añade a la solución HL3.1 para proporcionar la concentración requerida de Ca 2 + extracelular.
- Disecciones de las larvas se llevan a cabo a bajas concentraciones de Ca 2 + (para evitar la contracción muscular), utilizando HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, se mantienen en hielo.
- Los experimentos electrofisiológicos suelen ser registrados en HL3.1 + 1 mM CaCl 2, pero esto puede ser ajustado 0,4 a 1 mM Ca 2 + según sea necesario.
- La solución es HL3.1 filtro esterilizado antes de su uso, y almacenadas a 4 ˚ C.
Preparación de estimulación y registro de pipetas:
- Pipetas de grabación y estimulante se retiró con una Sutter P-2000 extractor de láser basado en micropipeta con los siguientes parámetros: calor = 390, filamento = 4, velocidad = 35, Delay = 200 y Pull = 0.
- Electrodos de estimulación se preparan a partir de pared delgada capilares de vidrio de borosilicato con extremos anchos que eran un poco más grande que el ancho de los axones del motor roto. Los extremos son en forma de firepolished para darle un acabado suave (con una pipeta Narashiga pulidora), para minimizar el daño al nervio. Electrodos de estimulación se llena con una solución de baño (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +).
- Los electrodos de registro se preparan a partir de 1,2 mm de vidrio de borosilicato, que se retiró para formar una pipeta fuerte (30-60 mW), y lleno de KCl 3M.
Parte 1: La disección de las larvas de Drosophila
- Larvas de tercer estadio errantes son disecados para exponer los músculos de la pared del cuerpo como se describió anteriormente 4.
- Disecciones se realizan en HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + en las placas de silicona pequeño (35 x 10 mm). HL3.1 solución debe ser enfriado con hielo para la disección con el fin de anestesiar a la larva, y se mantiene en hielo antes y durante la disección.
- Las larvas son disecados mediante los métodos descritos por Brent y McCabe (2008), que se ha modificado para los experimentos de electrofisiología y por la adición de 0,25 mM Ca 2 + a la solución de la disección HL3.1, y el uso de clavos cortos disección (~ 2 mm de longitud) que son menos probabilidades de golpear el objetivo del microscopio y de los electrodos durante un experimento.
- Después de la disección, los axones motores de las larvas se cortan. Esto se hace con suavidad la celebración de la CNS y elevarlo un poco para los nervios periféricos que inervan los músculos posteriores al ganglio ventral se puede cortar sin dañar los músculos (Figura 1). El cerebro se retira.
- La preparación de las larvas disecadas se lava dos veces con HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.
Figura 1. Esquema que muestra los pasos a seguir en el corte de los axones de motor de las larvas de disección. El sistema nervioso central se eleva con las pinzas y los axones motores se cortan en la base del cerebro.
Parte 2: registros intracelulares de las células musculares de larvas.
- Colocar la placa en el microscopio de disección de la electrofisiología y sumergir la preparación con HL3.1 + 1.5 mM Ca 2 + y fijar el electrodo de baño por lo que está en contacto con la solución.
- Todos los experimentos se llevan a cabo en el músculo 6 en el tercer segmento abdominal (A3). Los nervios periféricos que inervan los músculos se estimulan con un electrodo de succión 5.
- La posición del electrodo de estimulación en el primer plato para evitar las vibraciones cuando el electrodo intracelular está en su lugar. Coloque el electrodo de estimulación en las cercanías de la neurona motora inerva los músculos 6 y aplica la succión suave hasta que el nervio cortado está dentro de la pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no estirar los nervios cuando se aplica succión. Aumentar la pipeta ligeramente por lo que no está en contacto con el músculo y la posición de modo que no es tirar de las fibras nerviosas cortadas (Figura 2).
Figura 2. Un esquema de la musculatura y que inervan las neuronas motoras de un segmento abdominal de la larva de Drosophila. La posición de la pipeta y estimular los nervios cortados y el electrodo de registro en la posición de los músculos 6 se ilustran. - Intragrabaciones de celulares se hacen con microelectrodos fuerte lleno de 3 M KCl. La posición del electrodo de registro sobre el centro del músculo 6 en el tercer segmento abdominal (A3) y ajustar el offset de entrada para que se lea cero para la solución del baño. Baje lentamente el electrodo y el enfoque de los músculos bajo magnificación óptica de alta hasta que toque la superficie del músculo. Vea el osciloscopio para confirmar que el músculo ha sido penetrado. El potencial de reposo de la membrana debe ser de al menos 60 mV, o el animal no debe ser utilizado. Potenciales de placa terminal en miniatura esporádicos ahora debería ser visible. Salir de la celda se estabilice por un minuto antes de comenzar a grabar.
- Los cambios en el potencial de membrana se detectan con una etapa de la cabeza Axón HS-2A y 2B Axoclamp un amplificador y grabado con Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). El 2B Axoclamp está interconectado a un equipo que ejecuta software pCLAMP y trabaja en conjunto con la interfaz de Digidata 1322A.
- Las células se registraron durante 3 minutos sin ningún tipo de estímulos para medir las respuestas mEJP. Las huellas fueron analizados mediante el software de análisis de Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) y la amplitud mEJP y frecuencia determinada.
La estimulación del nervio:
- El extremo cortado de la neurona motora se estimula con una serie de pulsos de tensión cuadrados (0,3 ms de duración) a una intensidad que es suficiente tanto para los axones motores, para evocar una respuesta coherente en todo el músculo.
- El estímulo se genera con el Maestro-8 generador de impulsos, que está programado para entregar pulsos continuamente de acuerdo a la duración y los tiempos de intervalo.
- Espere cinco segundos entre los estímulos para la recuperación sináptica en la UNM.
- Al determinar la fuerza del estímulo, comience con el nivel más bajo y aumentar la intensidad lentamente a lo largo de varios ensayos. La intensidad del estímulo mínimo que se traduce en una respuesta evocada deben ser utilizados en experimentos.
- Cuando la intensidad del estímulo adecuado se alcanza, debe haber una EJP compuesto y una contracción muscular provocada por el estímulo.
- Registro de por lo menos 10 potenciales evocados de cada músculo y el promedio de las amplitudes.
Parte 3: Resultados de Representante
Figura 3. Grabación Representante intracelular del músculo 6, que muestra el evocado EJP es la respuesta a la estimulación eléctrica del nervio segmentario, y los potenciales de placa terminal en miniatura esporádica, o de mEJP. EJP amplitudes en el músculo sano 6 de larvas de tipo salvaje, como Cantón S, son por lo general alrededor de 40 mV y las amplitudes mEJP entre 3.1 mV.