Se describe la forma de medir cerca de la membrana y la dinámica global de calcio intracelular en los astrocitos cultivados usando la reflexión total interna y microscopía de epifluorescencia.
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Artículo de método
Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
El cerebro contiene células gliales. Los astrocitos, un tipo de célula glial, han sabido de largo para proporcionar una función de apoyo pasivo a las neuronas. Sin embargo, la evidencia creciente sugiere que los astrocitos pueden también participar activamente en la función cerebral a través de interacciones funcionales con las neuronas. Sin embargo, muchos aspectos fundamentales de la biología de los astrocitos siguen siendo controvertidas, poco claras y / o explorar experimentalmente. Una cuestión importante es la dinámica de los transitorios de calcio intracelular en los astrocitos. Esto es importante porque el calcio se ha consolidado como un importante segundo mensajero y como se ha propuesto que las elevaciones de los astrocitos de calcio puede desencadenar la liberación de los transmisores de los astrocitos. Sin embargo, no ha habido ninguna descripción detallada o la satisfacción de calcio cerca de la membrana plasmática de señalización en los astrocitos. Total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía es una herramienta poderosa para analizar los eventos de señalización fisiológicamente relevantes dentro de unos 100 nm de la membrana plasmática de las células vivas. En este sentido, el uso de microscopía TIRF y describir la manera de supervisar cerca de la membrana plasmática y la dinámica global de calcio intracelular casi al mismo tiempo. El perfeccionamiento y la aplicación sistemática de este enfoque tiene el potencial de dar a conocer los detalles precisos de la señalización del calcio astrocitos. Una comprensión detallada de la dinámica del calcio astrocitos puede proveer una base para entender si, cómo, cuándo y por qué someterse a los astrocitos y neuronas dependientes de calcio interacciones funcionales.
Protocolo
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El procedimiento experimental consta de dos partes principales que se describen de una manera paso a paso a continuación.
Parte 1: preparación de los cultivos de astrocitos del hipocampo
En pocas palabras, mezcla de neuronas del hipocampo astrocitos culturas fueron preparados utilizando un protocolo bien establecido 1,2,3. Hemos optimizado el procedimiento para obtener saludable astrocitos cultivados. Todos los procedimientos que se enumeran a continuación deben ser llevadas a cabo en un ambiente estéril, como una campana de flujo laminar.
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Discusión
Es un hecho bien establecido que los astrocitos mostrar elevaciones de calcio intracelular. Esto ocurre de forma espontánea, puede ser desencadenada por la actividad neuronal o por la aplicación de agonistas para activar los receptores en la superficie de los astrocitos 11. Una cuestión importante y polémica es si los astrocitos elevaciones de calcio intracelular puede desencadenar la liberación de moléculas de señalización que activan los receptores en las neuronas 11, 12. Esto es controvertido porque no ha habido evi.......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Uehara Memorial de Japón (a ES), así como la Fundación de Whitehall, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Premio Stein-Oppenheimer Fundación (a BSK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Cubreobjetos microscópicos VWR®, redondos, No. 1 | Herramienta | VWR international | 48380-068 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Reactivo | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminina de la membrana basal del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm | Reactivo | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Solución salina equilibrada de Earle’s (EBSS) (1X), líquida | Reactivo | Invitrogen | 14155-063 | |
| Medio mínimo esencial (MEM) (1X), líquido, contiene sales de Earle’s, pero sin L-glutamina ni rojo de fenol | Reactivo | Invitrogen | 51200-038 | |
| Solución líquida de penicilina-estreptomicina | Reactivo | Invitrogen | 15140-122 | |
| Solución de piruvato de sodio | Reactivo | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Solución de HEPES 1 M | Reactivo | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Suplemento N-2 (100X), líquido | Reactivo | Invitrogen | 17502-048 | |
| Suero de caballo, inactivado por calor | Reactivo | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reactivo | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Medio Neurobasal™ (1X), líquido sin rojo de fenol | Reactivo | Invitrogen | 12348-017 | |
| Suplemento libre de suero B-27 (50X), líquido | Reactivo | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamina-200 mM (100X), líquida | Reactivo | Invitrogen | 25030-149 | |
| Filtros para células | Herramienta | BD Biosciences | 352350 | |
| Placas múltiples de fondo plano BD Falcon con tapas, estériles | Herramienta | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reactivo | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reactivo | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Cloruro de calcio2 hexahidratado | Reactivo | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| Cloruro de magnesio2 hexahidratado | Reactivo | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Ácido HEPES libre | Reactivo | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucosa | Reactivo | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM, solución 1 mM en DMSO | Reactivo | Invitrogen | F-14217 | |
| Solución al 20% de Pluronic® F-127 en DMSO | Reactivo | Invitrogen | P-3000MP | |
| Aceite de inmersión TIPO DF | Microscopio | Cargill Labs | 16242 | |
| Cámara abierta para cubreobjetos redondos de 25 mm, volumen de 100 μl | Herramienta | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Plataforma P-2 para cámaras Serie 20, sin calefacción | Herramienta | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| Microesferas carboxiladas modificadas FluoSpheres, 0,1 μm, fluorescentes amarillo-verdosas (505/515), 2% de sólidos | Reactivo | Invitrogen | F8803 |
Referencias
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L.
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Reimpresiones y permisos
