Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Resumen

En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.

Resumen

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. El nematodo

Protocolo

Parte 1: Preparar nematodo crecimiento de los medios (NGM) placas

En esta sección se describe la preparación de los platos NGM sólida para su uso en el experimento de vida. Un experimento de vida útil básica requiere dos tipos de placas: las placas estándar NGM, que no contienen aditivos, y las placas Amp / FUDR, que tienen la ampicilina (Amp) y fluorodesoxiuridina (FUDR) añadido a la NGM. La ampicilina se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana externa. FUDR inhibe la división celular, reduce la producción de huevos, y evita que los huevos de incubar. El uso de FUDR para el análisis de la longevidad no afecta vida adulta y elimina la necesidad de transferir los gusanos cada pocos días con el fin de separarlos de la larva en crecimiento. Ambos tipos de placas se siembran con E. coli OP50 bacterias, que posteriormente asesinado por la exposición a los rayos UV.

1. Prepare NGM (véase la Sección 5 de la receta y notas de almacenamiento) y placas de identificación de Petri. Usted tendrá una placa de Petri de 60 mm por cada 10 ml de NGM. Si usted está comenzando con NGM previamente preparados sólidos, continúe con el paso 1.2. Si usted está comenzando con NGM recién autoclave, vaya al paso 1.4.
2. Fundir completamente NGM sólida en el microondas en alto en 30 pulsos de segundo. Los medios de comunicación remolino entre los pulsos para evitar burbujas de gas a presión se acumule.
3. NGM en lugar de líquido 55 ° C baño de agua o en el banco que se enfríe.
4. Una vez NGM alcanza los 55 ° C añadir 33 l de FUDR 150 mm y 100 L de 100 mg / ml de ampicilina por cada 100 ml NGM (por Amp / FUDR placas) y agitar para mezclar. Para placas NGM sin medicamentos adicionales vaya directamente al paso 1.5.
5. Utilizando una técnica estéril, pipeta de 10 mL en cada NGM 60 mm placa de Petri. Evitar la formación de burbujas, si es posible. Si se forman burbujas, que se pueden hacer estallar con una punta de la pipeta.
6. Deja los platos en la mesa con tapa para permitir que el NGM para solidificar y secar. Si es posible, dejar las placas en el banco durante 2 días antes de la adición de bacterias, pero un día va a funcionar si las placas son necesarios antes.
7. El día antes de terminar de secar los platos, líquido de semilla cultura LB con una colonia de una racha dulce de E. coli OP50 bacterias en agar LB. Usted debe preparar por lo menos 1 ml de una noche a la mañana OP50 cultura por placa de 60 mm.
8. Lugar OP50 cultura en 37 ° C agitador y permitir que las bacterias crecen durante la noche (la cultura debe llegar a la saturación).
9. Pellet OP50 bacterias al girar a 3.500 g durante 10 minutos.
10. Eliminar el 90% de las bacterias sobrenadante y resuspender a concentrar la cultura de 10x.
11. Pipetear 100 L de 10x concentrada OP50 la cultura en el centro de las placas NGM solidificado. Placas de agitar suavemente para extender cultivo de bacterias, si es necesario (lo ideal bacteria debe cubrir el área central de la NGM sin llegar cerca de las paredes de placas). Trate de no tocar la punta de la pipeta a la superficie de la NGM, como defectos en la superficie de los medios de comunicación permiten que las lombrices se introducen en la NGM.
12. Deja los platos en la mesa durante la noche para permitir que la cultura bacterias se seque en la NGM sólida (por lo general tarda aproximadamente 24 horas).
13. Una vez seco, exponer la superficie de las placas a una dosis UV suficiente para detener el crecimiento de las bacterias. Si estás utilizando un Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • Coloque las placas en la Stratalinker y quite las tapas
    • Cierre la puerta y encender el Stratalinker
    • "Energía" de prensa
    • Introduzca '9999 'usando el teclado
    • "Inicio" de prensa
    • Las placas estarán expuestas a los rayos UV durante unos 5 minutos
14. Las placas con las bacterias muertas por UV se pueden almacenar al revés a 4 ° C durante un máximo de un mes.

Parte 2: Realizar un huevo de tiempo por la que se adquieren a una edad sincronizado población de animales

En esta sección se genera una población de gusanos con una escotilla común-la fecha. Esto se logra al permitir que los adultos reproductivamente activas para poner los huevos en un plato por un período definido de tiempo y permitiendo que los huevos para desarrollarse.

1. (Opcional) Transferencia de aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa de NGM fresco sin FUDR. Deja las placas a 25 ° C a fin de que los gusanos se propaguen y que comer a través de todo el alimento de bacterias. Después de la comida bacteriana que se ha consumido gusanos recién nacidos entrará en la etapa de crecimiento arrestado Dauer. Usted empezará a ver larva Dauer todo dentro de una semana, dependiendo de cómo muchos gusanos que transfiera a la placa inicial. Dauer larvas se pueden utilizar para los próximos pasos para un máximo de un mes.
2. (Opcional) Transferencia de 20 a 30 Dauer larva de una placa de NGM fresco sin FUDR. En presencia de alimentos larva Dauer se convertirán en adultos reproductivamente activas dentro de 2 días y siguen siendo reproductivo activos por unos pocos días después a 25 ° C.
3. Transferencia de 10 a 15 adultos reproductivamente activos a una placa de NGM fresco sin FUDR. Este plato se conoce como la puesta de huevos tiempo (TEL) de placas.
4. Deje la placa de TEL a 25 ° C durante 6 horas a fin de que tque el tiempo los gusanos para poner sus huevos.
5. Eliminar los gusanos adultos de la placa TEL. Placa puede ser inspeccionada visualmente para detectar los huevos antes de retirar los adultos. Si los gusanos no han establecido un número suficiente de huevos de la placa de TEL se puede dejar a 25 ° C hasta un total de 24 horas antes de la eliminación de los gusanos adultos.
6. Coloque la placa de TEL a 20 ° C hasta que los huevos han eclosionado y los gusanos se han desarrollado hasta la etapa larval L4 (esto por lo general, toma 2 días de tipo silvestre de C. elegans, pero puede tomar más tiempo para las cepas con fenotipos de desarrollo lento).

Parte 3: Puntuación de los animales vida

En esta sección seguimos la edad sincronizado población de gusanos en la parte 2 hasta que mueren. Los gusanos se mantienen en Amp / FUDR placas para evitar que la producción de huevos y la contaminación bacteriana y se considera muerto cuando no responden a los estímulos externos.

1. Transferencia L4 larva de semillas Amp / FUDR placas. Para cada cepa o afección que se estudia, es típico para configurar 2-3 placas con 25 a 30 gusanos por placa. Imágenes de la C. etapas de la vida elegans se proporcionan para los de referencia (Figura 1) ^1.
2. Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C durante 24 horas.
3. Después de 24 horas, visualmente evaluar los gusanos, los medios de comunicación, y las bacterias. Transferencia de gusanos a un nuevo amplificador / FUDR placas si alguno de los siguientes se observa:
   • Los gusanos se han comido la mayoría de los alimentos bacteriana. A principios de los gusanos experimento duración de la vida tendrá que ser transferido 1 a 2 veces a la semana para evitar que las bacterias están agotando.
   • Un número significativo de larvas presentes. Esto es generalmente un indicio de que los gusanos fueron trasladados a las placas Amp / FUDR como adultos jóvenes en lugar de L4s y fueron capaces de poner unos huevos antes de la FUDR entró en vigor. El FUDR suele prevenir las larvas de llegar a ser adultos completa, pero de vez en cuando unos pocos se convierten en adultos y se confunden con los animales de experimentación.
   • Bacterias vivas / cada vez se observan. En general, la combinación de amplificador y UV-matar se asegurará de que ninguna bacteria viva contaminar el experimento, pero a veces ocurre.
   • El crecimiento de hongos que se observa en los medios de comunicación. Si se detecta a tiempo, el crecimiento de hongos por lo general se puede cortar con una punta de la pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta ser más grande que unos pocos milímetros de diámetro, por lo general es más fácil de transferir a los gusanos a una nueva placa.
   • Utilizar las posibilidades que la disección, determinar si cada gusano está vivo o muerto.
   • Golpear suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta a la interceptación.
   • Si el gusano de ellos no responden a tocar la placa, zoom en la región de la cabeza.
   • Golpee suavemente la cabeza del gusano con el pico de platino de transferencia. Puntuación del gusano como muerta si no responde moviendo su cabeza.
   • Gusanos muertos pueden ser retirados de la placa.
4. Anote la fecha y el número de gusanos que están vivos y los muertos.
5. Volver placas a 20 ° C.
6. Repita los pasos 3.3 a 3.6 cada 2 ó 3 días hasta que todos los gusanos han muerto.

Parte 4: Los resultados representativos.

Los datos en bruto producido por un experimento de nematodos vida es una lista de fechas con los números correspondientes de los gusanos que están vivos y los muertos de cada cepa ensayada. El número de gusanos que se mueren cada día suele ser invertido para calcular la proporción de gusanos vivos en todos los días (Figura 2A), que se representa gráficamente como una curva de supervivencia (Figura 2B, el día de la puesta de huevos tiempo se considera el día 0 ). La esperanza de vida para cada individuo del gusano en el estudio se puede calcular a partir del recuento de los gusanos que mueren cada día y se utiliza para el cálculo de tiempo de vida media y la mediana para la comparación entre las cepas. El recuento del número de gusanos vivos en cada día no se utiliza directamente en el análisis de vida útil. Gusanos mantenidos en medios sólidos de vez en cuando 'huir', o se arrastran hacia arriba la pared de la placa o por debajo de la media. El número de gusanos vivos en cada día se puede utilizar para determinar cómo los gusanos, muchos huyeron a lo largo del experimento. Gusanos que huyen normalmente se extirpan de análisis. Como punto de referencia, la duración de vida típica de la mediana de N2, el C. elegans cepa de tipo salvaje, mantenidos en el UV-mató a las bacterias a 20 ° C es de aproximadamente 25 días como medida de huevo.

Parte 5: Soluciones

Nematodo de crecimiento de los medios (NGM), 100 ml:
Combine:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Peptona
2 g	Agar
Autoclave durante 40 minutos y dejar enfriar a 55 ° C, a continuación, añadir:
100 L	1 M MgSO 4
100 L	5 mg / ml de colesterol
100 L	1 M de CaCl2
1.625 ml	1,5 M pH 6,0 KPI
NGM líquido puede ser utilizado de inmediato para verter en las placas o se deja solidificar y se almacenan a largo plazo a temperatura ambiente

Caldo Luria (LB), 1 litro:
10 g	BactoTryptone
5 g	Extracto de levadura
10 g	NaCl
10 ml	1 M Tris pH 8,0
1 L	agua desionizada
Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

1 M MgSO 4, 300 ml:
73,95 g	MgSO4
300 ml	agua desionizada
Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

5 mg / ml de colesterol, 200 ml:
1 g	colesterol
200 ml	100% de etanol
Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

1 M CaCl 2, 500 ml:
27,75 g	CaCl2
500 ml	agua desionizada
Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

1,5 M pH 6,0 KPI, 1L:
Combine:
31,4 g	KPI dibásico
179,6 g	KPI monobásico
850 ml	agua desionizada
Calor mientras se mezcla para permitir KPI en disolverse. Ajustar el pH a 6.0 con NaOH 10 N.
Añadir agua desionizada hasta 1 L.
Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

1 M Tris, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 ml	agua desionizada
Ajustar el pH a 8.0 con HCl.
Añadir agua desionizada hasta 500 ml.
Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

150 mM fluorodesoxiuridina (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 ml	agua destilada estéril
Almacenar a -20 ° C.

100 mg / ml de ampicilina (Amp), 10 ml:
1 g	Ampicilina
10 ml	agua destilada estéril
Almacenar a -20 ° C.

50 mg / ml carbenicilina (CARB), 10 ml:
500 mg	Carbenicilina
10 ml	agua destilada estéril
Almacenar a -20 ° C.

1 M isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), 10 ml:
2,38 g	IPTG
10 ml	agua destilada estéril
Almacenar a -20 ° C.

Figura 1. Imágenes de campo claro de la C. elegans etapas de la vida, incluyendo huevos, de los cuatro estadios larvales (L1 - L4) y adulto. Todos los paneles muestran hermafroditas, excepto la esquina inferior derecha, que muestra a un hombre adulto (Imagen de madera (1988)).

Figura 2. Los resultados representativos de una C. la vida elegans experimento lapso comparar salvaje N2 tipo de cepa a cepa que contiene una mutación en el gen daf-2. (A) Una tabla que muestra los datos recogidos, incluyendo el número de días desde que los gusanos fueron los huevos, el número de gusanos muertos observados cada día, y el porcentaje de la muestra original que permanecen vivos en cada día (calculada a partir de los recuentos diarios de los gusanos muertos) . (B) Supervivencia curvas correspondientes a los datos de vida útil previsto en (A).

Figura 3. Comparación Representante de la lipofuscina entre adultos jóvenes y viejos C. elegans. Imágenes brillantes de campo se muestran a la izquierda y DAPI imágenes del canal de fluorescencia a la derecha. Los paneles superiores muestran un gusano de 4 días de edad y paneles inferiores muestran un gusano de 11 días de edad (medida a partir de huevo).

Discusión

El control genético de la longevidad se ha estudiado extensamente en C. elegans, en gran parte debido a la facilidad y rapidez con que puede ser tiempo de vida determinado. El protocolo discutido en este artículo se describe un marco básico para la obtención de datos reproducibles esperanza de vida en C. elegans y también se puede aplicar a las especies relatednematode. ² Al hacer algunos cambios sencillos estos procedimientos pueden ser adaptados para medir duración de la vida bajo una vari...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar-agar	Reactivo	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicilina	Reactivo	MidSci	0339
BactoTriptona	Reactivo	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reactivo	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reactivo	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbenicilina	Reactivo	Biotecnología del Oro	C0109
Colesterol	Reactivo	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodesoxiuridina (FUDR)	Reactivo	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropil β-d-Tiogalactopiranósido (IPTG)	Reactivo	Biotecnología del Oro	I2481C5
KPi Dibasic	Reactivo	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reactivo	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reactivo	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reactivo	Fisher Scientific	S251
Tris	Reactivo	Sigma-Aldrich	T1503
Extracto de levadura	Reactivo	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)