El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de incienso, P. taeda, Y otras especies de coníferas. Aquí, se muestra pre-y post-hibridación manejo y técnicas de lavado que se pueden utilizar con esta matriz para obtener una mejor consistencia, artefactos reducidos y menores fondos.
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Artículo de método
Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray
En este artículo
Resumen
Resumen
PtGen2 es un microarray de cDNA que contiene 26.496 función amplificada EST pino taeda. La serie es producida en nuestro laboratorio para su uso por los investigadores que estudian la expresión de genes en las especies de coníferas de pino y otros. PtGen2 se desarrolló como resultado de nuestros esfuerzos de descubrimiento de genes de pino de incienso, y se compone de secuencias identificadas principalmente de tejidos de la raíz, sino también de la aguja y el tallo. 1,2 PtGen2 ha sido probado por hibridación de diferentes tintes de Cy-etiquetados ADNc objetivo de coníferas , utilizando tanto amplificada y no amplificada, los métodos indirectos de etiquetado, y también probó con una serie de condiciones de hibridación y lavado. Este vídeo se centra en la manipulación y elaboración de las diapositivas antes y después de pre-hibridación, así como después de la hibridación, con algunas modificaciones a los procedimientos desarrollados con anterioridad. 3,4 También se incluyen, en forma de texto único, son los protocolos que se utilizan para la generación, el etiquetado y la limpieza de s objetivo cDNA, así como información sobre el software utilizado para el procesamiento de datos de salida.
PtGen2 se imprime con un búfer de impresión de propiedad que contiene altas concentraciones de sal que puede ser difícil de eliminar por completo. Las diapositivas se lavan por primera vez en una cálida solución de SDS antes de la pre-hibridación. Después de pre-hibridación, las diapositivas se lavan con fuerza en varios cambios de agua para completar la eliminación de las sales restantes. LifterSlips ™ que se han limpiado y colocado en las diapositivas y etiquetados cDNA se carga en el cuidado de microarrays mediante una acción capilar que proporciona una distribución uniforme de la muestra a través de la diapositiva, y reduce la posibilidad de la incorporación de la burbuja. La hibridación de los objetivos de la matriz se realiza a 48 ° C en condiciones de alta humedad. Después de la hibridación, una serie de lavados estándar se realiza a 53 ° C y temperatura ambiente durante períodos prolongados. Procesamiento PtGen2 diapositivas utilizando esta técnica reduce la sal y la SDS-derivados artefactos a menudo se ve cuando la matriz se procesa con menos rigor. Hibridación de los objetivos derivados de varias fuentes diferentes de coníferas de ARN, el procesamiento del protocolo dado menos artefactos de fondo reducido, y proporcionan una mayor coherencia entre los diferentes grupos experimentales de arrays.
Protocolo
(Tenga en cuenta las secciones 1 - 4 No demostrada en Video)
Preparación de Cy-etiquetados objetivo cDNA
Lo que sigue es el protocolo que utiliza para la síntesis de cDNA a partir de ARN total de pino taeda y el etiquetado de cDNA indirecta antes de microarrays hibridaciones. Aunque a algunos no triviales se han realizado modificaciones, el protocolo de abajo es similar a la del manual de instrucciones proporcionado con superíndice Kit indirectos de la Invitrogen Etiquetado cDNA.
Parte 1: primer capítulo de reacción de síntesis de cDNA
- Mezclar y brevemente giro cada compon....
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Discusión
PtGen2 es un recientemente desarrollado, los microarrays de cDNA a medida que fue diseñado para ser utilizado principalmente por la comunidad de investigación de pino taeda. Los resultados preliminares generados hasta el momento han demostrado la matriz para ser una herramienta valiosa en la evaluación de los acontecimientos de la transcripción que se producen en respuesta a estrés por sequía, así como en el seguimiento de los cambios que se producen durante el desarrollo del embrión en el pino marítimo, Pinus pinas.......
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Agradecimientos
El etiquetado, la hibridación y los protocolos de lavado de este documento contiene algunas modificaciones a los desarrollados anteriormente por el Dr. J. Quackenbush, mientras que en el Instituto de Investigación Genómica (TIGR), el Dr. Shawn Levy en la Vanderbilt microarray Shared Resource (VMSR), y el Dr. Rob Alba, mientras que en el Instituto Boyce Thompson (BTI), la Universidad de Cornell.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Tampón de prehibridación | Tampón | 5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA | ||
| Buffer de hibridación | Tampón | 30% formamida, 5X SSC, 5X Denhardt’s, ARN de poliA al 1% (Invitrogen, POLYA.GF), SDS al 0,1% | ||
| Solución de lavado n.º 1 | Tampón | 1X SSC, 0,2 % SDS, precalentar a 43°C | ||
| Solución de lavado n.º 2 | Tampón | 0,1X SSC, 0,2 % SDS | ||
| Solución de lavado n.º 3 | Tampón | 0.1X SSC | ||
| Alcohol isopropílico | Reactivo | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Otro | Falcon BD | 352070 | |
| Tubos cónicos de 15 mL | Otro | Falcon BD | 352196 | Utilice este tapón o uno similar colocado en la parte inferior de cada tubo cónico de 50 mL durante la centrifugación |
| Frasco de Coplin | Wheaton | 900520 | ||
| Placa de tinción &y estante | Otro | Wheaton | 900200 | |
| Albúmina del suero bovino (BSA) | Otro | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| ARN poliA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Etiquetado indirecto de ADNc SuperScriptTM | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNasa | Kit | Ambion | AM1907 | |
| Sistema | ||||
| Colorante Cy-5 | Reactivo | GE Healthcare | PA25001 | |
| Colorante Cy-3 | Reactivo | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Otro | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipo | GeneMachines | JHYB200003 |
Referencias
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dhar....
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