Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.
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Artículo de método
La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota
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Resumen
Resumen
La proteína verde fluorescente (GFP) basado en timelapse en vivo de imágenes es una técnica poderosa para el estudio de la regulación genética de procesos dinámicos, como la morfogénesis de tejidos, la adhesión célula-célula, o muerte celular. Embriones de Drosophila que expresan GFP son fácilmente imágenes utilizando microscopía estereoscópica o confocal. Uno de los objetivos del protocolo en vivo de imágenes es reducir al mínimo los efectos perjudiciales tales como la deshidratación y la hipoxia. Protocolos anteriores para la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis que consistía en colocar los embriones dechorionated en el aceite de halocarbonos y intercalando entre ellos una halocarbonos permeables al gas de membrana y un cubreobjetos
Protocolo
Preparación
- Recoger los embriones en el estándar placas de agar jugo de uva-4. Es conveniente utilizar un sistema automatizado de Drosophila huevo Collector (flymax Scientific Equipment Ltd.). El uso sincrónico realizaron colecciones embrión reducir el número de dechorionations que se deben realizar a fin de obtener un número suficiente de embriones en la etapa de desarrollo deseado.
- Prepare una diapositiva dechorionation uniendo un pedazo de cinta de doble cara a un portaobjetos de microscopio, retire el papel protector de la cinta.
- Prepare la cámara de imágenes en vivo cortando un pedazo de tejido para que quepa en el pozo ....
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Discusión
Se describe un nuevo método de preparación de los embriones de Drosophila para el análisis de imágenes en vivo, lo que llamamos el protocolo de gota. Por desgracia, no es posible utilizar el protocolo de gota si se trabaja con un microscopio invertido. En este caso la técnica de sándwich (como se describe en el resumen anterior) debe ser utilizado y la compresión de los embriones sigue siendo una preocupación.
En experimentos donde se mide la forma y el tamaño de la celda con el fin de calcu.......
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Agradecimientos
Agradecemos el apoyo de la HRB a través de una beca de descubrimiento, así como herramientas de investigación y subvención de instrumentos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También reconocemos H. Oda y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar materiales genéticos que se utilizaron en las secuencias de imágenes en vivo ejemplo.
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Materiales
Equipamiento de serie y los materiales necesarios para preparar a los embriones para vivir de imágenes utilizando el protocolo de gota incluyen los siguientes elementos: portaobjetos, cubreobjetos (22 x 40 mm, n º 2), cinta de doble cara, pinzas de joyero (Dumont estilo N º 5 ), halocarbonos aceite serie 56 y serie 700 (halocarbonos Products Corp.), un cuchillo o una hoja de un solo filo de la navaja, un pañuelo de papel, tijeras, agua destilada, la cinta de uso general, y una pipeta adecuada para la entrega de l 20-40. El protocolo de imágenes en vivo también se requiere una cámara de medida de imagen en vivo. Este es preparado por el corte de 5 mm que placa de policarbonato de plástico para las dimensiones de un portaobjetos de microscopio estándar (75 x 25 mm) y el uso de un rotor para crear una profunda depresión en la diapositiva 3 mm (20 x 55 mm). El acceso a un microscopio estereoscópico (microscopio de disección) y una fuente de iluminación de fibra óptica es también necesaria.
Referencias
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retracti....
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Reimpresiones y permisos
