Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Resumen

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Resumen

Todo el montaje

Protocolo

1. FIJACIÓN

1. Fix embriones noche a 4 ° C con 4% paraformaldehído (PFA) en PBS.
2. Quitar arreglar y lavar 2 x PBS, 5 minutos cada uno, a temperatura ambiente (RT).
3. Embriones manualmente dechorionate en PBS en una placa de vidrio depresión usando pinzas de relojero. Después de dechorionation, los embriones se transfieren por medio de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno.
4. La transferencia de embriones a través de una serie de 25%, 50% y 75% de metanol en PBS durante 5 minutos cada uno.
5. Sustituir el líquido con metanol al 100%, incubar 5 minutos y luego vuelva a ....

Discusión

El protocolo presentado aquí funciona bien con las sondas que dar una señal fuerte limpia después de la tinción de 30-45 minutos en una fosfatasa alcalina típica mediada por la reacción. Antes de realizar la fluorescencia en el protocolo de hibridación in situ, siempre prueba de nuestras sondas utilizando el estándar de protocolo no fluorescente (siempre en el material complementario junto con el protocolo de síntesis de la sonda). Hemos tenido menos éxito con los fluorescentes en el protocolo de hibridación in situ uti.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de paraformaldehído al 16%, grado EM	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluir al 4% en PBS 1,33x (1x final). Almacenar en alícuotas de 2 ml a –20°C
Proteasa K, grado PCR recombinante	Roche Group	03115879001	Preparar una solución stock de 20 mg/ml en agua. Almacenar en alícuotas de 1 ml a –20°C
Reactivo de bloqueo	Roche Group	11096176001	Preparar una solución stock al 10% en tampón de ácido málico 1x. Almacenar en alícuotas de 50 ml a –20°C. Estable tras múltiples ciclos de congelación/descongelación.
Anti-fluoresceína-POD, fragmentos Fab	Roche Group	11426346910	Aliquotar y almacenar a -20°C. Mantener una alícuota de trabajo a 4°C.
Anti-digitoxigenina-POD, fragmentos Fab	Roche Group	11207739910	Igual que arriba.
Sistema TSA Plus Fluoresceína	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Preparar cada vial del reactivo TSA solo cuando sea necesario. Disolver en 60μl de DMSO. Almacenar a 4°C.
Sistema TSA Plus Cyanine5	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	Igual que arriba
Sistema TSA Plus Cyanine3	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	Igual que arriba
Kit TSA #16 tyramida AlexaFluor647 (más HRP-anticuerpo de cabra anti-conejo IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Disolver el reactivo de tyramida en 150μl de DMSO, aliquotar y almacenar a –20°C.
RNasa, libre de ADNasa	Roche Group	11119915001	Suministrada como solución de 500μg/ml
Yoduro de propidio	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Suministrado como solución de 1 mg/ml en agua.