Ratón cromafín aislamiento de células

Resumen

Médula suprarrenal cromafines sistemas de cultivos celulares son muy útiles para el estudio del acoplamiento excitación-secreción en el establecimiento in vitro. Este protocolo se ilustra el método utilizado para diseccionar las glándulas suprarrenales y luego aislar a la región medular al eliminar la corteza suprarrenal. La digestión de la médula en una sola las células cromafines se demostró entonces.

Resumen

Médula suprarrenal cromafines sistemas de cultivos celulares son muy útiles para el estudio del acoplamiento excitación-secreción en el establecimiento in vitro. Este protocolo se ilustra el método utilizado para diseccionar las glándulas suprarrenales y luego aislar a la región medular al eliminar la corteza suprarrenal. La digestión de la médula en una sola las células cromafines se demostró entonces.

Protocolo

Abreviaturas:
ACC - adrenal de células cromafines, E. sol. - solución de la enzima, E. DMEM - Modificado enriquecido Dulbecco Medio Eagle

1. Preparación
   1. Añadir la papaína a la cantidad deseada de E. sol. (40 unidades de papaína / 1 ml E. sol.)..
   2. Activar la papaína con carbogen durante unos 15 minutos en hielo. Buffer oxigenar de Locke sobre el hielo también.
      
2. Disección
   1. El uso del ratón 8-10 semanas.
   2. Antes de la digestión eliminar oxigenada búfer de Locke y el lugar en el hielo.
   3. Consulte el vídeo para el procedimiento de disección.
   4. Una vez eliminado, glándulas lugar en oxigenada búfer de Locke.
      
3. Preparación de la glándula
   1. Eliminar la grasa de la glándula.
   2. Franja de la corteza de la glándula.
      
4. La digestión enzimática
   1. Filtro estéril oxigenada papaína.
   2. Haz cuatro grupos de la papaína oxigenada sobre una placa de Petri.
      1. 3 piscinas debe ser de 100uls.
      2. Una de las piscinas debe ser de 400uls.
   3. Lave medullae a través de piscinas
      1. Primero a través de las 3 piscinas 100ul.
      2. Luego, a través de la piscina 400ul
      3. Pippette 300ul E. sol. y la médula piezas de piscina 400ul en el tubo de microcentrífuga.
      4. Qrap parafina en el tubo de microcentrífuga y el lugar en el 37 ° C baño de agua durante 20 minutos.
      5. Recuerde que debe seguir para oxigenar restantes sol. E. contienen papaína.
      6. Después de 20 minutos más filtro estéril E. sol..
      7. Sustituir las viejas E. medullae baño sol. con el recién filtrada E. sol..
         
5. Trituraciones
   1. Aspirar y desechar E. sol..
   2. Lave medullae en 1 ml E. DMEM.
   3. Aspirar y desechar E. DMEM.
   4. Añadir 300ul E. DMEM y triturar 20 veces con 1 ml punta.
   5. Corte la punta 200ul con hoja de afeitar estéril.
   6. Triturar 5-10x con la punta cortada 200ul.
   7. Deseche E. DMEM piezas medullae baño. Medio contendrán residuos.
   8. Añadir 300uls DMEM E. medullae piezas.
   9. Triturar con la punta de 200ul 20x
   10. Pippette E. DMEM al tubo de microcentrífuga withough piezas medullae. Medio contendrán ACC libre.
   11. Añadir 300uls DMEM E. medullae piezas.
   12. Triturar medullae con una aguja de calibre 23,5 jeringa 20x.
   13. Combine E. DMEM tanto trituraciones. Medullae piezas no deben estar presentes y que ahora debe tener una apariencia featherlike.
       
6. Enchapado
   1. Microfuga E. DMEM de los pasos trituración dos últimos durante 2,5 minutos a 3,7 g s.
   2. Resuspender el pellet en 50uls-200 DMEM E., en función de posteriores experimentos.
   3. Placa 10-30uls en un cubreobjetos.
   4. Espere 15 minutos para que las células se adhieran.
   5. Añadir 750uls de E. DMEM.