La detección de ubiquitinación de proteínas

Resumen

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas In vivo Y tubos de ensayo In vitro.

Resumen

Ubiquitinación, la unión covalente de la ubiquitina polipéptido que se dirigen a proteínas, es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Estos incluyen la activación de la enzima ubiquitina E1, E2 ubiquitina-conjugación enzima, y ​​E3 ubiquitina ligasa. A diferencia de E1 y E2, E3 ubiquitina ligasas pantalla especificidad de sustrato. Por otro lado, numerosas enzimas deubiquitylating tienen un papel en el procesamiento de las proteínas polyubiquitinated. Ubiquitinación puede resultar en un cambio de la estabilidad de las proteínas, localización celular y la actividad biológica. Las mutaciones de los genes implicados en la vía de ubiquitinación / deubiquitination o alteración de la función del sistema ubiquitina están asociados con muchas enfermedades diferentes humanos, tales como varios tipos de cáncer, neurodegeneración, y trastornos metabólicos. La detección de ubiquitination alterado o normal de las proteínas diana pueden proporcionar una mejor comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas

Protocolo

La detección de la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas

1. Transfectar células cultivadas con plásmidos que expresan la proteína de interés y (epítopo de etiquetado de la versión) ubiquitina.
2. Hacer búfer completo lisis celular (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con ortovanadato de sodio 2 mM, 50 mM de fluoruro de sodio, y los inhibidores de la proteasa.
3. Lisis de las células con 100 l buffer de lisis celular por placa (6 cm plato). Si un plato más grande se utiliza, ajustar el volumen en consecuencia. Agite el plato con cuidado para que el tampón de lisis cubrir toda el área de las células cultivadas.
4. R....

Discusión

En esta presentación, lo primero que describió las medidas que permitan detectar modificaciones ubiquitina a una proteína de interés en los cultivos de células de mamíferos. Con el fin de detectar la ubiquitinación específicamente en la proteína de interés, no en las proteínas que interactúan de forma no covalente, se utilizó una condición estricta para la lisis celular, inmunoprecipitación y el lavado de ^1,3. Ubiquitinación, detectado por inmunoprecipitación de la proteína diana en un estado severo seguido d.......