Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

Resumen

Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

Resumen

En este protocolo se describe el uso de fluorescentes Speckle Microscopía (FSM) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de actina en las células PtK1. Una ventaja única del FSM es su capacidad para captar el movimiento y la cinética de rotación (armado / desarmado) de la red de F-actina en las células vivas. Esta técnica es particularmente útil en la obtención de mediciones cuantitativas de la dinámica de actina F-cuando se combina con el software de visión por computador (qFSM). Se describe la selección, la microinyección y la visualización de las sondas fluorescentes de actina en las células vivas. Es importante destacar que procedimientos similares se aplican a la visualización de las otras asambleas macomolecular. FSM ha sido demostrada para los microtúbulos, filamentos intermedios y los complejos de adhesión.

Protocolo

Sección 1: La obtención de la etiqueta fluorescente para actina FSM

Materiales necesarios: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga

1. Un componente clave para la adquisición de buenas películas FSM exige el correcto etiquetado de actina (u otras proteínas del citoesqueleto), con el fluoróforo de su elección.
   Se recomienda el uso de fluoróforos Alexa (488, 568 longitudes de onda) y X-rodamina derivados de éster de succinimidilo que se dirigen a los residuos de lisina expuestos en la superficie de la actina.
2. Al elegir su fluoróforo y su longitud de onda apropiada, ase....

Discusión

Varios factores clave son cruciales para el éxito de la obtención de imágenes de manchas, manchas por bueno comenzar y terminar con la calidad de la actina marcados con fluorescencia. Una proporción alta de etiquetado de tinte a la actina monómero, en torno a 0,4 a 0,7 se asegurará de que van a aparecer manchas brillantes y discreto, mientras que la proteína marcada en sí debe ser soluble y libre de los agregados. Igualmente importante es el procedimiento de microinyección. Para asegurar la homeostasis celular normal (y.......

Materiales

Inyección de tampón (IB)
50 mM de glutamato de potasio
0,5 M MgCl2 (Anexo 2a)
Almacenar hasta 2 años a -20 ° C

 

G-buffer
2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Anexo 2a)
0.2 mM CaCl2 (Anexo 2a)
Añadir justo antes del uso:
0,2 mM ATP (ver receta a 100 mM)
0,5 mM 2-mercaptoetanol

Almacenar hasta 1 día a 4 ° C