Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

Resumen

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Resumen

En los protocolos clásicos de proteínas tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB), las soluciones con un alto contenido de disolventes orgánicos tóxicos e inflamables (metanol, etanol o 2-propanol) y ácido acético se utilizan para la fijación, tinción y decoloración de las proteínas en un gel de SDS después -PAGE. Para acelerar el procedimiento, el calentamiento de la solución de tinción en el horno de microondas por un corto período de tiempo se utiliza con frecuencia. Esto usualmente resulta en la evaporación de metanol tóxicos o peligrosos, etanol o 2-propanol y un fuerte olor a ácido acético en el laboratorio que deben evitarse por motivos de seguridad. En un protocolo publicado originalmente en dos solicitudes de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), una composición alternativa de la solución de tinción se describe en la que no solvente orgánico o ácido se utiliza. El CBB se disuelve en agua bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) y 35 mM HCl se agrega como el único compuesto otros en la solución de tinción. El CBB staning del gel se realiza después de SDS-PAGE y minuciosamente del gel en agua bidestilada. Al calentar el gel durante el lavado y la tinción de pasos, el proceso puede terminar más rápido y no compunds tóxicos o peligrosos se evapora. La tinción de las proteínas ocurre ya dentro de 1 minuto después de calentar el gel en solución de tinción y se desarrolla completamente después de 15-30 minutos con un fondo azul que es un poco desteñido por completo por el lavado prolongado del gel teñido con agua bidestilada, sin afectar a la proteína manchado bandas.

Protocolo

Parte 1: Preparación de la solución de tinción CBB

1. 60-80 mg de CBB G-250 se disuelven en 1 litro de agua bidestilada por agitación durante 2-4 horas. Por último, 3 ml de HCl concentrado, se añade a la solución de color azul oscuro con agitación durante un minuto y se almacena en la oscuridad para su uso posterior. La solución se puede almacenar durante varias semanas hasta varios meses sin perder su eficacia manchas.
2. HCl concentrado debe ser manejado con el cuidado habitual und usada bajo una campana de humos. La solución final será aproximadamente a pH 2, por lo que se debe utilizar guantes y cualquier contacto con la piel debe ser evitado.

Discusión

• Los pasos de lavado son fundamentales para la tinción eficiente de las proteínas. Una reducción del tiempo de lavado por debajo de 2 min o disminución del volumen de agua (<50 ml) puede dar lugar a bandas de proteínas pálido azul, muy probablemente debido a una mayor cantidad de residuos SDS en el gel.
• Si las proteínas van a ser analizados por espectrometría de masas, los pasos de calentamiento en el horno de microondas debe ser omitido, el tiempo para el lavado del gel extendido a unos 10 minutos en cada paso y el tiempo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	se podría utilizar igualmente cualquier otro CBB G-250
Ácido clorhídrico concentrado