Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

Resumen

Explantes de la región central de la lente de la rata epitelio diferenciar sincrónicamente cuando se cultivan en presencia de FGF-2. Microscopio de inmunofluorescencia de esas culturas puede ofrece información novedosa sobre la expresión génica y la señalización de eventos relacionados con la diferenciación terminal.

Resumen

La superficie anterior del cristalino ocular está cubierta por una monocapa de células epiteliales, que proliferan en una zona anular subyacente del cuerpo ciliar. Después de la división, estas células migran posteriormente, en la difusión de la retina FGF induce a diferenciarse en una amplia posterior alargada de las células del cristalino fibras que componen el grueso de la lente. Diferenciación de las células epiteliales de la lente en las fibras del cristalino puede ser inducida in vitro por cultivo de explantes de la región central del epitelio anterior en presencia de FGF-2. Explantes son preparados a partir de las lentes de ratas recién nacidas por la extirpación del cristalino del ojo y agarrar la cápsula del cristalino en la parte posterior con unas pinzas de disección. La cápsula posterior es suavemente desgarrado y se presiona hacia abajo en la parte inferior de plástico de un plato de cultivo de tejidos. Las regiones periféricas del explante se quitan con un bisturí y la zona central luego se cultiva en presencia de 100ng/ml FGF-2 durante el tiempo de 2-3 semanas, dependiendo de los parámetros a estudiar. Dado que las células epiteliales en explantes cultivados diferenciar en sincronía aproximada durante un período de días o semanas, el curso temporal de la señalización y la expresión génica se puede determinar mediante técnicas moleculares, bioquímicos y farmacológicos. La inmunofluorescencia es un auxiliar poderoso de estos métodos, ya que demuestra la localización subcelular de las proteínas de interés y puede revelar las consecuencias fisiológicas de manipulaciones experimentales de las vías de señalización.

Protocolo

Parte 1: La eliminación de las lentes

Materiales y reactivos:

1. Micro-Tijeras de disección, puntas curvas, romas, (por ejemplo as.RS-5983, Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), micro-disección pinzas, punta curva (como Roboz # RS5137).
2. Medio de suspensión: Medio 199 conteniendo 0,1% de albúmina de suero bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml Reactivos anfotericina B. están disponibles a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procedimiento:

1. La eutanasia a las ratas recién nacidas (de 2-4 días), de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD.
2. Eliminar los párpados con una tijera quirúrgica. Presione suavemente con unas pinzas curvas en los lados opuestos de la órbita del ojo para forzar el ojo pared hacia afuera. Haga una pequeña incisión en la parte posterior del ojo con las tijeras. Pulsando con pinzas contra el lado del ojo frente a la incisión, la lente y una pequeña cantidad de vítreo adjunta a continuación, se puede forzar a través de la ruptura, lo que permite la lente para ser recogidos con pinzas curvas. Se debe tener cuidado de no romper la cápsula del cristalino.
3. Utilice las pinzas curvas para la transferencia de las lentes de 60 mm a un plato de plástico de 5 ml de cultivo de tejidos que contienen medio caliente, suspensión estéril.

Parte 2: Microdisección de explantes

Materiales y reactivos:

1. Micro pinzas de disección, 0,1 mm de consejos, (como Roboz RS-4976). Usamos aleación Dumostar debido a la flexibilidad de la punta, pero otras aleaciones de acero también son aceptables. Pinzas con puntas de 0,1 mm más delgado que no son recomendables, ya que tienden a romperse o doblarse durante este procedimiento.
2. Suspensión medio (véase la Parte 1)
3. Sin suplementar F12 de Ham o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procedimiento:

1. Los siguientes pasos deben realizarse en un lugar limpio, sin corrientes de aire ambiente utilizando herramientas de disección estéril y medio estéril.
2. Utilizando un microscopio de disección estéreo, limpiar las lentes de los tejidos adheridos con la punta de pinzas 0,1 mm y transferirlos a una placa de cultivo con medio segundo de 60 mm 5 ml de suspensión estéril (este paso ayuda a reducir la contaminación). Con las pinzas, la transferencia de la cantidad deseada de lentes para una placa de cultivo de 35 mm que contiene 5 ml medio estéril, sin suplemento. (A menudo utilizamos F12 de Ham (Invitrogen) para este paso, porque la concentración de colorante más baja hace una disección más fácil, sin embargo, Medio 199 también es aceptable ningún antibiótico o cualquier otro tipo son necesarias en este paso..) Hasta 12 explantes se puede hacer en el centro de un plato de este tamaño. Sin embargo, un plato de 35 mm se debe utilizar, aunque menos explantes se deben hacer, ya que las herramientas de disección no se puede manipular con facilidad en un plato más pequeño. La transferencia de la cápsula que contiene las lentes restantes a un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C hasta que se necesiten.
3. Identificar la parte posterior de la lente. Hay muchas maneras de reconocer esto: 1) La parte posterior es más redonda que la anterior, que es ligeramente achatada, 2) las lentes de recién nacidos de ratas forman cataratas en frío cuando se enfrían a temperatura ambiente durante la disección. Si la catarata fría no ha llenado completamente el objetivo, la parte posterior es la parte más alejada de la zona opaca. Si la opacidad ha llenado la lente, el calentamiento de la placa a 37 ° C durante unos minutos lo contrario. El lado posterior se puede identificar como las reformas de cataratas en la refrigeración. 3) Los vestigios de la túnica vascular del cristalino pueden ser visibles en la parte posterior. 4) La sutura posterior puede ser visible en la parte posterior. La identificación de la parte posterior correctamente es esencial, ya que es donde la cápsula se abrió. Apertura de la lente en la parte anterior se rompa el epitelio.
4. Una vez que la parte posterior se ha identificado, que a su vez hacia arriba y captar el lente de las pinzas de la izquierda (para un trabajador de la derecha). A continuación, una pizca de la cápsula posterior con las pinzas adecuadas para producir un pequeño pliegue.
5. Mientras mantiene la cápsula posterior con las pinzas derecha, sujete la tapa de la cápsula con las pinzas a la izquierda y tirar de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas para hacer un pequeño desgarro en la cápsula.
6. Mientras sujeta el borde de la cápsula retráctil con las pinzas, tire de él hacia abajo, primero en un lado y luego por la otra, presionando en el plástico de la cápsula con las pinzas. Repita esto varias veces, moviendo todo alrededor del ecuador de la lente, hasta que la cápsula esté bien conectado a la placa en muchos puntos. De la cápsula en su lugar con las pinzas de la izquierda, agite suavemente la masa de las fibras con las pinzas derecho de romper la unión entre las células de las fibras y células epiteliales en el ecuador del cristalino. Luego empuje la masa de fibra de distancia, rodar fuera de la cápsula / epitelio, que permanece unido a la parte inferior de laplato. Continuar este proceso con todos los objetivos en el plato. Retire y deseche las masas de fibra (o guardarlos congelados como fuente de proteínas del cristalino para otros estudios).

Parte 3: Microdisección y la cultura de los explantes centrales

Materiales y reactivos:

1. Desechable estéril de bisturí, hoja n. º 15, (Cincinnati quirúrgica Co. Cincinnati, OH)
2. Fosfato de solución salina estéril tamponada con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Medio de cultivo: medio de suspensión que contiene 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. de St. Louis, MO).

Procedimiento:

1. Con un bisturí estéril, recortar el epitelio periférico (PE), que contiene las células en las primeras etapas de diferenciación (Figura 1), dejando una plaza central alrededor de 2,0 mm de lado, que consiste en el centro de las células epiteliales sólo (CE) (Figura 1B).
2. Transferir el plato que contiene los explantes central para un gabinete de bioseguridad. Lavar 3 veces con PBS estéril que contiene calcio y magnesio, y una vez con 1 ml de medio fresco, equilibrado y suspensión (37 ° C CO, 5% _2). Estas soluciones reducen en gran medida la probabilidad de contaminación.
3. Añadir 2 ml de medio de cultivo para inducir la diferenciación de ^una, y el lugar de los explantes en un humidificado, cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2. Períodos de la cultura puede ser tan corto como unas pocas horas o extenderse hasta dos o tres semanas, dependiendo del parámetro en estudio. Medio debe ser cambiado cada dos o tres días.

Parte 4: La recolección de los explantes para el análisis de los acontecimientos relacionados con la diferenciación

1. Explantes de recolección para el análisis de proteínas o ARN

Materiales:

1. Pinzas Microdissecting
2. Tampón de lisis SDS o ARN más tarde-

Procedimiento:

1. Al final del período de incubación, se elimina el medio de cultivo.
2. Con el microscopio de disección estéreo, extraiga con cuidado los bordes de cada explante.
3. Levante cada explante con las pinzas y transferirlo a un tubo que contiene buffer de lisis SDS 100μl (para el análisis de proteínas) o ARN más tarde (para el análisis de ARN). Agite la punta de las pinzas en la solución para asegurar que el explante no se pegue a las pinzas.

2. Explantes de la cosecha de inmunofluorescencia

Materiales y reactivos:

1. Tampón fosfato salino con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Tampón fosfato salino (sin calcio y magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Paraformaldehído al 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA)
4. Pinzas Microdissecting
5. Pluma hidrofóbicas marca
6. Portaobjetos de vidrio
7. 0,25% de Triton X-100 en tampón fosfato salino.

Procedimiento:

1. Enjuague explantes brevemente en PBS que contenía calcio y magnesio.
2. Para reparar tejidos mediante la adición de 4% de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Retire el fijador y reemplazar con tampón fosfato salino. Explantes se fija un poco rígida, lo que les permite ser levantado y trasladado a las diapositivas de cristal para inmunotinción.
4. Coloque una pequeña gota de PBS (sin calcio y magnesio) en la diapositiva para ayudar a posicionar el tejido y evitar que se ondulen. Con unas pinzas microdissecting, levante el explante y la inserta en la caída en la diapositiva. Sin tocar el explante, retire con cuidado el líquido con una mecha de papel para aplanar el explante en el cristal y dejar que el tejido seco en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos.

Figura 1 A. El epitelio periférico expresa una diferenciación específica de las proteínas. El explante mostró fue immunostained para N-cadherina inmediatamente después de microdisección. Expresión se ve en una banda de células en el epitelio periférico, lo que indica que las células de esta región han empezado a diferenciarse. B. El epitelio periférico puede ser recortada para eliminar las células que expresan N-cadherina y otras proteínas de diferenciación específica. El anillo de color rojo representa la ubicación de las células que expresan N-cadherina, mientras que la pequeña plaza que se indica en gris representa el cuadrante del epitelio muestra en el panel 1A. El epitelio periférico puede ser removido por cuatro cortes de bisturí, dejando una plaza central que contiene las únicas células que todavía no han empezado a diferenciarse.

Discusión

El objetivo de la rata sistema de explante ha sido utilizado con éxito por una serie de laboratorios para estudiar la diferenciación terminal de las células epiteliales de la lente de las fibras del cristalino ^21,3,4,5. Cuando se expone a FGF-2 en 100ng/ml los explantes comenzará a mostrar cambios en la señalización dentro de ⁶ minutos, con cambios en la morfología y la expresión de genes que aparecen de forma secuencial durante varios días ^3,4,5. Las culturas permanecen viables durante 2-3 semanas si se tiene cuidado para evitar la contaminación.

Los explantes central descrito en este protocolo son especialmente útiles para el estudio de la secuencia de eventos asociados con la diferenciación, ya que contienen pocas o ninguna las células que expresan marcadores de diferenciación antes de FGF-2 se añade ^1,5. Las células se diferencian de forma sincrónica, como un grupo, por lo que es posible seguir la evolución temporal de las señales y los eventos asociados con la diferenciación de la transcripción. Explantes de cultivo para diferentes periodos de tiempo por lo tanto proporciona información precisa acerca de los eventos temporales de secuencia. Inhibidores específicos se pueden añadir al medio de cultivo para identificar las vías de señalización correspondiente. Los explantes se puede utilizar para analizar la expresión de proteínas por electroforesis en gel de SDS e inmunoblotting o para analizar la expresión de ARNm específicos por RT-PCR. Proteínas gama rendimientos 20-50 mg / explante y el rendimiento de ARN es de aproximadamente 200 a 600 ng / explante, dependiendo de la duración del período de cultivo. Por lo general, encontramos que 6.5 explantes por plato proporcionará suficientes proteínas o ARN de varios ensayos. ARN a partir de explantes también se puede utilizar para preparar cDNA para la evaluación de la expresión génica mediante análisis de microarrays, que permiten identificar nuevos genes que pueden ser críticos para la diferenciación. Los explantes pueden ser transfectadas. A pesar de la eficiencia de transfección es generalmente bajo, es suficiente para el ensayo de genes indicadores ^{4, 7, 8.} Microscopio de inmunofluorescencia de los explantes proporciona un complemento útil a los métodos bioquímicos para determinar la localización subcelular de las proteínas de interés. Por lo tanto, la preparación y la cultura de los explantes lente rata ofrece un potente sistema para el estudio de la diferenciación terminal de lentes en los mamíferos, que pueden complementar las técnicas in vivo, tales como la generación de ratones transgénicos y knock-out.