La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.
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Artículo de método
El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad de las células germinales embrionarias (EG) a diferenciarse en células germinales primordiales (PGC) y más tarde en los gametos durante las primeras etapas de desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo en 10.5-11.5 días después de embriones de ratón coitum (dpc). El desarrollo de las crestas gonadales de embriones de ratón (C57BL6J) se disocian por rotura mecánica con colagenasa, está chapada en una capa de fibroblastos de embriones de ratón de alimentación (MEF-CF1) que antes era mitóticamente inactivados con mitomicina C en la presencia de los medios de octavos de final y que será completada con un inhibidor de la leucemia Factor (LIF), el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), y factor de células madre (SCF). El uso de estos métodos optimizados para la identificación del PCG, el aislamiento, y el establecimiento de condiciones de cultivo permite que las culturas a largo plazo de las células EG de más de 40 días. Las líneas embrionarias germinales de células mostró fenotipo embrionario y la expresión de marcadores utilizados común del estado pluripotente. El aislamiento y la derivación de células germinales en la cultura una herramienta para entender su desarrollo in vitro y ofrece la oportunidad de controlar el daño acumulado en los niveles genéticos y epigenéticos que después de la exposición al estrés oxidativo.
Protocolo
Parte 1: La laparotomía ratón embarazadas
- Por dislocación cervical, la eutanasia a una mujer embarazada ratón C57BL6J femenina en 10,5-11,5 DPC.
- Limpia el abdomen con jabón antiséptico, y luego, se le exige.
- Después de afeitarse, lavar el abdomen con una solución salina.
- A continuación, seque el abdomen con una gasa estéril.
- Cubrir el ratón con un campo estéril.
- Haga una incisión ventral con las pinzas y tijeras de disección.
- Identificar y eliminar todo el útero de la cavidad abdominal. Embriones de ratón será visible en el interior del útero.
- Transferencia al útero en una placa Petri ll....
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Divulgaciones
Esta investigación se llevó a cabo después de la revisión y el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión (IACUC) la aprobación de nuestro protocolo de ratón # 08030 (el papel del oxígeno de especies reactivas-ROS en el desarrollo de la línea germinal y la formación de tumores: mantener y criar protocolo) en la Universidad Estatal de Mississippi.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la ayuda inestimable de: Dr. Neal First y Kourtney Wilkinson manuscrito de edición, Dr. Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford y Mike Basett de ayuda con el cuidado y entrenamiento de los animales en las instalaciones de MSU ALAC ratón acreditados, el Dr. Dwayne Sabio por su ayuda con la microscopía y la captura de imágenes, César Monroy, Swoope Hannah, y Bobbie Huddleston por su ayuda en la producción de vídeo en la MSU. Esta investigación fue financiada por la Oficina de Investigación Institucional y el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Mississippi.
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Materiales
Pinzas N º 14 y 15, 35 mm de bisturí, tijeras de disección, campos quirúrgicos, jabón antiséptico, solución salina al 0,9%, la gasa, el contenedor de hielo de espuma, cuchilla de afeitar, bisturí de 35 mm, pinzas finas N º 4 y 5, con aguja fina con bromas mango, hojas de papel filtro, y tiró de pipetas de vidrio.
Equipo: microscopio estereoscópico de disección, la fuente de luz Schott Fostec, microscopio invertido, micropipeta 10 y 200ul, centrífuga, el gabinete de seguridad biológica.
Equipo: microscopio estereoscópico de disección, la fuente de luz Schott Fostec, microscopio invertido, micropipeta 10 y 200ul, centrífuga, el gabinete de seguridad biológica.
Referencias
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
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Reimpresiones y permisos
