Summary
Dextransulfat-Natrium (DSS) im Trinkwasser verabreicht wird eine etablierte murine entzündlichen Verletzungen Modell der akuten Colitis. Dieses Protokoll beschreibt die Methode für die DSS-Behandlung und der Aufbereitung der Gewebe.
Abstract
- Morbus Crohn Colitis vor allem Colitis ulcerosa und die Kolon-Variante des Morbus Crohn, Colitis können von viralen oder bakteriellen Infektionen, ischämischen Insult oder Autoimmunerkrankungen auftreten. Akute Kolitis kann mit Bauchschmerzen und Blähungen, Malabsorption, Durchfall, Hämatochezie und Schleim im Stuhl zu präsentieren. Wir sind dabei, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Umwelt, Genetik und epithelialen Barriere Dysfunktion bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Tiermodellen der Colitis wurden wesentliche Fortschritte in unserem Verständnis dieser Krankheit zu verstehen. Ein beliebtes Modell beinhaltet Ergänzung des Trinkwassers von Mäusen mit niedermolekularen Dextran Natriumsulfat (DSS), die sich in epithelialen Schäden und eine robuste entzündliche Reaktion in den Dickdarm mehrtägigen
Protocol
Teil 1: Injury-Repair Colitis Modell
- Baseline Gewicht sollte für jede Maus vor Beginn der DSS-Behandlung erzielt werden.
- Für eine 3% (w / v) Dextransulfat Natriumsalz-Lösung in Wasser und Filter mit einem 0,45 um Celluloseacetat-Filter.
- Ersetzen Sie Trinkwasser in der Maus Käfig mit 3% DSS-Lösung für 4 Tage. Die Mäuse sollten keinen Zugang zu einer anderen Quelle von Wasser (dh Ausschluss Tipps automatisierte Bewässerungssysteme angelegt).
- Am vierten Tag, ersetzen Sie die DSS-Lösung mit Wasser für weitere drei Tage, so dass einige Kolon Epithelzellen Erholung. Die Mäuse sollten am vierten Tag gewogen werden, um systemische Auswirkungen der Kolitis zu quantifizieren. Der Gewichtsverlust ist mit schweren Verletzungen häufig.
- Am Tag 7 wiegen und Opfer der Mäuse. Mäuse durch inhalative Überdosis Isofluran oder anderen institutionell kann eingeschläfert werden, genehmigt IACUC Methoden.
Teil 2: Necropsy und Ernte von Colon
- Expose der Bauchseite der Maus und sichere Beine zu ungehinderten Zugang zu den Unterleib zu gewährleisten. Wet den Bauch komplett mit 70% Ethanol.
- Fassen Sie die Mittellinie des Bauches mit dem Gewebe einer Pinzette und erstrecken sich nach oben so Zelten der Haut. Verwenden Sie spitzen Schere den Bauch damit Freilegung der Bauch-Inhalte incise. Erweitern Sie den Einschnitt an der Spitze der Schwertfortsatz an der Mittellinie und dann entlang der unteren Seite der Rippenbogen bilateral zu verlängern.
- Identifizieren Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Sorgfältig sezieren / necken den Dickdarm aus den umliegenden Mesenterium. Transect dem Doppelpunkt tief im Becken an dem distalen Kolon und Rektum frei. Transect den Doppelpunkt am colonocecal Marge auf den proximalen Kolon frei. Es muss während dieses Prozesses ergriffen werden nicht auf den Doppelpunkt als Reinigung des Dickdarms wird es problematisch, wenn Perforation tritt Schäden.
- Mit einer 20G Fütterung Nadel und 10 ml Spritze, intubieren und bündig den Doppelpunkt mit eiskaltem PBS, bis das Eluat ist völlig frei von Stuhl.
- An diesem Punkt, wenn makroskopische Analyse mit einem Binokular gewünscht wird, kann die Doppelpunkte als "Würstchen" fixiert werden. Wenn histologische Analyse nur gewünscht wird, als Teil gehen 4 "machen Swiss Rolls für die histologische Analyse der akuten Colitis".
Teil 3: Verarbeitung als "Wurst" für makroskopische Analyse des gesamten Dickdarms
- Es ist wichtig, die richtige Ausrichtung des Dickdarms zu halten, daher halten das distale Ende des Dickdarms am nächsten an den Betreiber. Schneiden Sie zwei Stücke von nicht-resorbierbares Nahtmaterial (SP116 1,5 metrischen geflochtene Seide), eine ca. 1 cm in der Länge, die anderen 2 Zoll.
- Verwenden Sie die 2-Zoll-Stück der Naht zu vernähen distalen Ende als an den Rand nahe wie möglich unter Beibehaltung einer guten Abdichtung.
- Legen Sie eine 20G Nadel Fütterung mit 5 ml 10% gepuffertem Formalin Phosphat in das proximale Ende des Dickdarms. Lose Krawatte das verbleibende Stück der Naht unmittelbar proximal des Bulbus der Fütterung Nadel. Fassen Sie den Doppelpunkt fest an die Glühbirne der Fütterung Nadel und ziehen Formalin, bis der Darm erweitert wird. Ziehen Sie den Knoten in den Faden, wie Sie die Fütterung Nadel zurückziehen und verlassen damit den infundiert, erweitert Doppelpunkt als "Wurst".
- Füllen Sie eine 15 ml konische Röhrchen mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat und Ort des Dickdarms in die Röhre. Fix für 24 Stunden.
- Abgießen Formalin und ersetzen mit 70% EtOH für weitere 24 Stunden. (Doppelpunkte können in 70% EtOH unbegrenzt gelagert werden bei Raumtemperatur.)
- Entfernen Sie den Doppelpunkt aus dem konischen Rohr und schneiden die Fäden an beiden Enden mit einem Skalpell, man aufpassen, nicht den Doppelpunkt beschädigen. Denken Sie daran, dass das distale Ende der längsten Stück Schnur hat. Cut in Längsrichtung von der distalen zum proximalen Ende des Dickdarms, so dass es ein langer Bogen bildet. An diesem Punkt kann der Darm unter einem Binokular betrachtet werden.
Teil 4: Making Swiss Rolls für die histologische Analyse der akuten Colitis
- Es ist wichtig, die richtige Ausrichtung des Dickdarms zu halten, daher halten das distale Ende des Dickdarms am nächsten an den Betreiber.
- Messen Sie die Länge Doppelpunkt. Diese Metrik ist ein weiterer Indikator für die Schwere der Verletzungen. Colitis erhöht Ödeme und verkürzt die gesamte Dickdarm Länge.
- Mit spitzen Schere, längs einschneiden von distal nach proximal Ende des Dickdarms. Verwenden Sie feine Spitze Pinzette, um entweder Rand des Einschnitts zu erfassen und seitlich offen arbeiten Sie Ihren Weg nach distal-> proximal, damit die Anzeige der Doppelpunkt als eine flache Platte.
- Rollende den Dickdarm erfordert eine Pinzette und eine Zweihand-Technik. Fassen Sie entweder Rand des distalen Rand mit einer Pinzette. Gehen Sie nacheinander roll Dickdarm durch Drehen und Loslassen der Zange Verfahren zum proximalen Rand. So eine Spirale mit einer dritten Dimension oder "Swiss Roll".Zur Aufrechterhaltung der gerollter Form, fassen Sie die Rolle fest mit einer Pinzette und Transekt mit einem 27G1 / 2 Nadel. Befestigen Sie die Nadel durch Verbiegen der Nadel, sobald es aus der Rolle.
- Legen Sie die Rolle in einem entsprechend gekennzeichneten Gewebekassette und in ein Glas mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat bei Raumtemperatur für 24 Stunden zu Gewebefixierung zu gewährleisten.
- Abgießen Formalin und ersetzen mit 70% EtOH für weitere 24 Stunden. (Doppelpunkte können in 70% EtOH unbegrenzt gelagert werden bei Raumtemperatur.)
- Sobald die Probe festgesetzt worden ist, kann es sein, in Paraffin eingebettet, geschnitten und montiert auf Folien für die histologische Analyse.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Das DSS-Modell für akute Kolitis erlaubt dem Forscher, zu erhalten, zu beheben, und zu analysieren, einen Doppelpunkt, dass die Modelle akuten Kolitis. Als die Schweizer Rolle geschnitten und montiert wird, sollte sie bilden einen repräsentativen Ausschnitt der gesamten Dickdarms, wenn gerollt richtig (Abbildung 1). Die montierten Rollen können mit H & E angefärbt werden, um das Ausmaß der Schäden in den Dickdarm zu bestimmen, von dem distalen (innen) zum proximalen (außen) Ende (Abbildung 2). Immunhistochemie kann auch an der Schweizer Rolle zu identifizieren und zu quantifizieren Entzündungsinfiltrate durchgeführt werden. Wenn die Wurst-Methode korrekt abgelaufen ist, werden die festen Doppelpunkt erweitert werden und die gesamte Schleimhaut-Oberfläche können leicht manipuliert werden und unter dem Binokular (Abbildung 3) angesehen.
Abbildung 1. Die ordnungsgemäß ausgeführt "Swiss roll". (A) Der Doppelpunkt ist von distal nach proximal gerollt, durchtrennt mit einer Nadel und gesichert durch Biegen des Endes der Nadel. Es ist dann in einer Gewebekassette zur Fixierung angebracht. (B) H & E gefärbten 5 &mgr; Abschnitt eines Swiss roll aus dem Darm einer Maus mit DSS (d = distalen Kolon p = proximalen Kolon) behandelt wurde.
Abbildung 2. DSS behandelt Doppelpunkte Anzeichen einer akuten Kolitis. Entzündung und Krypta Schäden sind in der DSS-behandelten Dickdarm deutlich im Vergleich zu einem Wasser-behandelten Kontrollgruppe.
Abbildung 3. Ein Beispiel für eine "Wurst". Die Wurst mit Formalin infundiert und komplett ausgebaut. Einem leichten Winkel wird anwesend sein zweitrangig gegenüber der natürlichen Krümmung des Dickdarms. Das eröffnet Wurst sollten flach.
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Discussion
Dieses Protokoll kann geändert werden, um akute Verletzungen, Verletzungen zu reparieren, oder chronische Dickdarm-Verletzung Prozesse zu modellieren.
Akute Verletzungen Änderung:
DSS-Behandlung ad lib für 4-6 Tage durch sofortige Opfer gefolgt
Injury-Repair Änderung:
Injury mit 4-6 Tagen DSS Behandlung durch Erholungsphase von 3-4 Tagen und Opfer (wie in oben beschriebenen Protokoll) gefolgt.
Chronische Colitis Änderung:
Mäuse sind auf drei Fünf-Tage-Zyklen von 3% DSS mit 16 Tage der Erholung zwischen jedem Zyklus gesetzt. Mäuse sind nach dem letzten 16-tägigen geopfert.
Es gibt einige Probleme, die Forscher müssen sich bewusst sein, mit diesem Modell:
- Variabilität in Ort der Verletzung: In unseren Händen, sehen wir eine überwiegend distal Verletzungsmuster, mit relativer Aussparung des proximalen Kolon und Zökum. Andere haben mehr proximal Vorherrschaft der Verletzungsmuster berichtet.
- Environmental Variabilität. Es gibt erhebliche Umweltauswirkungen Variabilität. Dies dürfte zum Teil auf Unterschiede in der Darmflora, Ernährung und andere umweltbezogene Aspekte betreffen.
- Dieses Modell ist unwirksam, wenn mit hohem Molekulargewicht DSS verwendet wird (dh 500.000 Da).
- Es gibt erhebliche Belastung Variabilität mit diesem Modell 4.
Biochemische Analyse des Dickdarms kann durch die Entnahme von Proben aus dem proximalen oder distalen Rändern durchgeführt werden. Abhängig von der Schwere der Verletzung kann dies Auswirkungen auf Ihre Fähigkeit, eine histologische Injury Score zu generieren. In vivo BrdU-Markierung, um die Proliferation messen kann durch intraperitoneale Injektion von 16,7 g / kg BrdU 2 Std. vor dem von α-BrdU IHC Verarbeitung gefolgt Opfer erreicht werden.
Als Alternative zu der "Wurst", kann der Dickdarm feste völlig flach sein. Den Boden einer Tupperware Behälter mit Whatman-Papier und genießen Sie das Papier mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat. Dissect dem Doppelpunkt wie in "Teil 2: Necropsy und Ernte von Colon" beschrieben. Auch hier halten das distale Ende des Dickdarms am nächsten an den Betreiber. Mit spitzen Schere, längs einschneiden von distal nach proximal Ende des Dickdarms. Mit feinen Spitzen einer Pinzette fassen entweder Rand des Einschnitts und seitlich offen arbeiten, damit die Anzeige der Doppelpunkt als eine flache Platte. Übertragen Sie diese flache Platte, die mit Wasser befeuchtete Whatman-Papier. Decken Sie die abgeflachte Doppelpunkt mit einem anderen Stück von Whatman und nass mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat. Die Whatman sollten vollständig in Formalin abgedeckt werden, aber nicht so viel, dass es abhebt des Dickdarms. Seal die Tupperware und fix für 24 Stunden. Entfernen Sie den Doppelpunkt aus der Tupperware und legen Sie es in 10 ml 70% igem Ethanol in einem 15 ml konischen Rohr. (Doppelpunkte können in 70% EtOH unbegrenzt gelagert werden bei Raumtemperatur.)
Es gibt mehrere Methoden zur Quantifizierung von Kolon-Verletzungen 5,6,7. Eine Methode, zum Beispiel verwendet eine Multi-Parameter-Skala, einschliesslich: Entzündung, soweit Engagement, Regeneration, Krypta Schäden und Prozent Beteiligung 8.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Vanderbilt IACUC gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Eine Förderung von NIH (1 K08 DK080221-01) und Vanderbilt institutionellen Fonds für die Entwicklung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
