Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.
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Artículo de método
Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra es un modelo ideal de comportamiento celular durante el desarrollo de imágenes en vivo. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y por lo tanto fácilmente accesible en todas las etapas de desarrollo. Además, su claridad óptica permite imágenes de alta resolución de la célula y de dinámica molecular en el medio natural del embrión intacto. Estamos utilizando un enfoque de imágenes en vivo para analizar los comportamientos celulares durante la migración neuronal células de la cresta y la consecuencia y la orientación de los axones neuronales.
Imágenes en vivo es particularmente útil para comprender los mecanismos que regulan los procesos de motilidad celular. Para visualizar los detalles de la motilidad celular, tales como la actividad protrusiva y dinámica molecular, es ventajoso para etiquetar las células individuales. En el pez cebra, la inyección de ADN plásmido se obtiene un patrón de mosaico la expresión transitoria y ofrece claras ventajas sobre otros métodos de etiquetado celular. Por ejemplo, las líneas transgénicas con frecuencia etiqueta a poblaciones enteras de células y por lo tanto pueden dificultar la visualización de las protuberancias finas (o cambios en la distribución molecular) en una sola célula. Además, la inyección de ADN en el estadio de una célula es menos invasiva y más precisa que las inyecciones de colorante en las etapas posteriores.
Aquí se describe un método para el etiquetado de cada desarrollo de las neuronas o las células de la cresta neural y las imágenes de su comportamiento in vivo. Se inyecta el plásmido de ADN en una célula de embriones etapa, que se traduce en la expresión del transgen mosaico. Los vectores contienen células específicas de los promotores que dirigen la expresión de un gen de interés en un subconjunto de neuronas sensoriales o las células de la cresta neural. Proporcionamos ejemplos de células marcadas con GFP membrana selectiva o con una sonda de biosensor que permite la visualización de la F-actina en las células vivas 1.
Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.
Protocolo
1. Montaje de diapositivas y las diapositivas de imágenes de la inyección
Diapositivas de inyección:
- Prepare elastómero de silicona Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice el Sylgard de enlace de tres de vidrio para microscopio estándar portaobjetos, apilando una diapositiva en la parte superior de la intersección de las otras dos diapositivas, que están dispuestos lado a lado en los bordes largos. El carro superior crea una esquina en ángulo recto o "muro" entre la parte superior e inferior se desliza.
- Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables.
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Discusión
La concentración óptima de ADN inyectado puede variar dependiendo del tamaño y la fuerza del promotor de la construcción y debe ser determinada empíricamente. La inyección de ADN en exceso puede conducir a los embriones saludables con una extensa muerte celular, mientras que muy poco se traducirá en una proporción muy pequeña de los embriones inyectados expresar el transgén. El nivel de expresión de ADN se correlaciona con la fuerza de la señal de fluoróforo, el cual varía de célula a célula. Aunque la clasificación de .......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 NS042228 para MCH El confocal Olympus FV1000 fue adquirido con una instrumentación NIH subvención compartida S10RR023717 al Departamento de Zoología de la Universidad de Washington (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tricaina (metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Kit de elastómero de silicona Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Kit QIAfilter Plásmido Midi | Qiagen | 12243 | |
| Agarosa de punto de fusión baja | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
Referencias
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U.
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Reimpresiones y permisos
