En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.
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Artículo de método
Modelo murino de CD40-activación de las células B
En este artículo
Resumen
Resumen
La investigación sobre células B CD40 ha demostrado que mejora la capacidad de activación de la presentación de antígenos. Cuando se estimula con la interleucina-4 y CD40 ligando (CD40L), las células B se puede ampliar sin problemas a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica dentro de 14 días a cantidades muy grandes de muy pura de células B CD40-(> 10
Protocolo
El protocolo para la generación de murino CD40-linfocitos B activados (mCD40B) a partir de esplenocitos se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de murino CD40 ligando (CD40L) que expresan las células HeLa (tmuCD40L HeLa), que se utiliza como placa- obligados células alimentadoras. La parte B describe la actual murino CD40-B cultura.
A. Preparación de las células de alimentación (tmuCD40L HeLa)
El HeLa tmuCD40L es un adherente línea humana de células epiteliales, lo que nunca debe ser totalmente confluente. Las células son por lo tanto, dividido dos veces por semana. El cultivo de más de más ....
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Discusión
Las modificaciones de este protocolo son posibles, especialmente en relación con el origen de CD40-estímulo y el tipo de cepa de ratón utilizada, también está dando en la generación eficiente de las células B CD40 murino activado. Ahmadi et al. han mostrado resultados similares para los fibroblastos de ratón transfectadas con CD40 murino-ligando. En este contexto de la presentación de xeno-antígeno puede ser excluido con certeza, pero los estudios intensivos sobre la seguridad y la toxicidad in vivo no da señal.......
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Divulgaciones
Los experimentos fueron realizados de acuerdo con las directrices nacionales y europeas para la cría de animales de laboratorio. Refiriéndose a la ley de bienestar animal alemán los animales fueron controlados periódicamente por las autoridades competentes.
Agradecimientos
Amablemente las gracias al Dr. Clemens Wendtner para proporcionar tmuCD40-ligando línea celular HeLa.
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Materiales
A. Preparación de los medios de comunicación:
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alimentador de medio celular de tipo salvaje | Alimentador de selección de células medianas | ||
| Reactivo | Concentración | Reactivo | Concentración |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamina | 300 mg / mL | L-Glutamina | 300 mg / mL |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamicina | 15 mg / ml | Gentamicina | 15 mg / ml |
| Higromicina B | 0,2 mg / ml |
| mCD40-B medio de lavado | mCD40 B-medio de cultivo | ||
|---|---|---|---|
| Reactivo | Concentración | Reactivo | Concentración |
| D-MEM | D-MEM | ||
| L-Glutamina | 580 mg / ml | L-Glutamina | 580 mg / ml |
| Glucosa | 4,5 mg / ml | Glucosa | 4,5 mg / ml |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamicina | 15 mg / ml | Gentamicina | 15 mg / ml |
| MEM | 0,1 mm (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Otros reactivos:
| Reactivo | Empresa | El número de orden |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco | REF 41965 |
| Dulbeccos PBS (10x) | PAA | No gato H15-011 |
| Gencin | Seleccione Delta | Arte No 7395800 |
| FBS | LONZA | Gato No DE14-802C |
| Tampón HEPES | PAA | No gato S11-001 |
| MEM AANE | Invitrogen Gibco | REF 11140 |
| Higromicina B | PAA | No gato P02-015 |
| Recombinante murino interleucina-4 | Immunotools | Gato No 12340045 |
| La ciclosporina A | Novartis | No NDC 0078-0109-01 gato |
| Tripsina / EDTA (10 veces) | Invitrogen Gibco | REF 15400-054 |
C. Otros materiales:
| Reactivo | Empresa | El número de orden |
|---|---|---|
| Puntas de pipeta estériles | Sarstedt | |
| 6 y placa | NUNC | Gato No 140675 |
| Tubo cónico de 50 ml | BD Falcon ™ | Gato No 352070 |
| Frasco de cultivo de tejidos | Sarstedt | Gato No 83.1813.002 |
Referencias
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M.
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Reimpresiones y permisos
