Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Resumen

Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en Bacillus subtilis Células.

Resumen

Tanto en procariotas y eucariotas responden al daño del ADN a través de una compleja serie de cambios fisiológicos. Alteraciones en la expresión génica, la redistribución de las proteínas existentes, y el montaje de nuevos complejos de proteínas puede ser estimulada por una variedad de lesiones en el ADN y no coincidentes de pares de bases del ADN. Microscopía de fluorescencia se ha utilizado como una poderosa herramienta experimental para la visualización y cuantificación de estas y otras respuestas a las lesiones del ADN y para supervisar el estado de replicación del ADN dentro de la compleja estructura subcelular de una célula viva. Fusiones traduccionales entre las proteínas fluorescentes reportero y los componentes de la replicación del ADN y la maquinaria de reparación se han utilizado para determinar las señales que se dirigen a proteínas de reparación del ADN de sus lesiones afines

Protocolo

Cultivos en crecimiento de las células para la microscopía

1. Uno o dos días antes de la imagen, preparar el B. subtilis cepa que contiene la proteína de fusión de traducción que desea visualizar. Rondas de prueba de los pasos 1A y 1B será necesario determinar qué condiciones de crecimiento ofrece las mejores imágenes de la cepa. En la mayoría de los casos, las células deben ser fotografiado durante la fase de crecimiento exponencial.

1. Para algunos B. cepas subtilis (en particular cepas, que crecen muy poco debido a la integración de la fusión traduccional entre el gen de interés y las b....

Discusión

Ensayo y error están obligados a encontrar las condiciones de exposición de las imágenes de mayor calidad para cada cepa, nos encontramos con que una milésima de segundo es apropiado para las imágenes de luz blanca, mientras que las exposiciones de 100 a 2000 ms son apropiados para las buenas prácticas agrarias (FITC) y FM4 64 (TRITC ) imágenes. Tiempo de exposición puede variar en función de los equipos de imágenes utilizados. Se recomienda el uso de una cepa por portaobjetos de microscopio de 15 y para el más simple d.......

Materiales

Recetas específicas solución ^1:

S7 10x ₅₀ sales
0,5 M MOPS
100 mM de sulfato de amonio
50 mM fosfato de potasio monobásico
Filtro de esterilización, y el abrigo S7 ₅₀ medios de comunicación en papel de aluminio antes de su almacenamiento

Metales 100x
0,2 M _de MgCl2
70 mM _de CaCl2
5 mM _MnCl2
0,1 mM _ZnCl2
100 mg / ml Tiamina HCl
2 mM HCl
0,5 mM FeCl ₃ *
dH ₂ O al volumen final
* FeCl ₃ se añade al final, para evitar la precipitación.
Después de la esterilización de filtros, envuelva 100x solución de metal en lámina.

S7 ₅₀ medios de comunicación
1x S7 ₅₀ sales
1x metal
1% de glucosa
0,1% de glutamato
40 mg / mL de triptófano
40 mg / mL de fenilalanina
H ₂ O destilada a volumen final

Spizizens 10x (g / L)
151,4 mM de sulfato de amonio (20 g / L)
803,8 mM fosfato de potasio monobásico (140 g / L)
440,9 mM fosfato de potasio dibásico (60 g / L)
34,0 mM citrato de sodio (10 g / L)
16,6 mM MgSO ₄ (2 g / L)
dH ₂ O al volumen final
Filtro de esterilización