La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e inestable In vivo, Lo que permite su aislamiento con estrictas técnicas de purificación de proteínas complejas. Aquí se presenta una técnica para que las células en un cultivo de entrecruzamiento seguido por el aislamiento de complejos de proteínas por inmunoprecipitación.
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Artículo de método
El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética
En este artículo
Resumen
Resumen
La naturaleza dinámica de los mecanismos celulares con frecuencia se basa en las asociaciones de proteínas transitoria y / o débiles. Estas interacciones de baja afinidad excluye métodos estrictos para el aislamiento e identificación de las redes de proteínas alrededor de una proteína de interés. El uso de productos químicos reticulantes permite la estabilización selectiva de las interacciones lábiles, evitando así las limitaciones de bioquímica para la purificación. Aquí se presenta un protocolo susceptible de células en cultivo que utiliza un agente de reticulación homobifuncionales con un brazo espaciador de 12 Å, ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP). DSP se separa por reducción de un puente disulfuro en la molécula. La reticulación en combinación con la cromatografía de inmunoafinidad de proteínas de interés con bolas magnéticas permite el aislamiento de complejos de proteínas que de otro modo no resistiría la purificación. Este protocolo es compatible con las técnicas regulares de Western blot y puede ser ampliado para la identificación de proteínas por espectrometría de masas 1.
Stephanie A. Zlatic y Pearl V. Ryder contribuyeron igualmente a este trabajo.
Protocolo
1. Preparación para la reticulación
- Será necesario que la placa de un número suficiente de células para permitir el aislamiento de 500 g de proteína por cada tubo de reacción estándar. Un único tubo puede ser suficiente para la identificación de los interactores putativo de una proteína de interés por inmunoblot. En este caso, material de cordón atado puede ser eluida con tampón de muestra SDS-PAGE (inmunoprecipitación). Para el análisis de espectrometría de masas, el número de reacciones estándar debe ser aumentado por lo menos diez veces y complejos de proteínas debe ser eluida por fuera de la competencia con un péptido antígeno reconocida por el anticue....
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Discusión
DSP, una membrana permeable, reticulante químicamente reduce con un brazo espaciador de 12 A se utiliza para estabilizar las interacciones proteína transitoria 1,2,3,4. Aquí se ejemplifican esta estrategia con el complejo adaptador AP-3 un complejo de proteínas solubles, que reconoce y clasifica las proteínas de membrana en vesículas de endosomas 5. AP-3 se une selectivamente al transportador de zinc ZnT3 y la quinasa de lípidos fosfatidilinositol-4-quinasa alfa de tipo II, pero no del receptor de .......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud de VF (NS42599 y GM077569).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato | Invitrogen | P4417 | Disolver 1 tableta en 200 mL de agua; añadir MgCl2 hasta una concentración final de 1 mM y CaCl2 hasta una concentración final de 0,1 mM |
| Ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Sensible a la humedad, almacenar en un recipiente hermético a 4°C |
| DMSO (dimetilsulfóxido) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Tritón X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, anticuerpo de oveja anti-IgG de ratón | Invitrogen | 110.31 | Las perlas también están disponibles como anticuerpo de oveja anti-conejo |
| Imán Dyna-Mag-2 | Invitrogen | 123-21D |
Referencias
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G.
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Reimpresiones y permisos
