Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

Resumen

SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez.

Resumen

SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Estos sistemas ofrecen una amplia gama de sustratos fluorescentes optimizado para una amplia gama de instrumentos de imagen. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez. Hay dos pasos para usar este sistema: la clonación y expresión de la proteína de interés como una fusión SNAP-etiqueta, y el etiquetado de la fusión con el sustrato SNAP-etiqueta de la elección. El SNAP-tag es una pequeña proteína humana sobre la base de O

Protocolo

Revestimiento de células CHO-K1:

1. Agregar 50-100μl de células CHO-K1 que han sido trypsinized acuerdo con los protocolos estándar de 6 ml de completar F-12K.
2. Mezcle la suspensión de células pipeteando arriba y abajo varias veces, entonces alícuota de 300 l de suspensión celular con tripsina a cada pocillo de una solución estéril de 8 de cámara Lab-Tek II cubreobjetos cámaras con # 1.5 borosilicato cubreobjetos cámaras (Nalgene Nunc Int.;. Product # 155409; Lote: 100808-8-0).
3. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante la noche.

La transfección transitoria de células CHO-K1 con pSNAP-ADRB2 y H2B-pSNAP:

1. Compruebe las cámaras de cultivo de células sembradas en el día anterior en busca de la densidad celular y la salud.
2. Etiqueta el número apropiado de tubos de microcentrífuga.
3. En una campana de flujo laminar, creado mezclas complejas de transfección de acuerdo a la tabla de ejemplo siguiente, utilizando 0,3 g pSNAP-ADBR2 ADN plásmido de control o de 0,3 mg de ADN de control pSNAP-H2B plásmido, 1 l de TransPass D2 y 1 l de TransPass V por reacción.

   plásmido	número de reacciones	l de medio libre de suero	l de D2 TransPass	l de TransPass V	l de ADN plásmido	l de D2/reaction TransPass	l de TransPass V / reacción	ng del ADN / reacción	ADN conc. (Ng / l)	l de ADN de plásmido / reacción
   SNAP-ADRB2	5	236.5	5	5	3.5	1	1	300	472,34	0.7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0.6
   Burlarse de	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Primero, mezclar el suero libre de F-12K con el ADN del plásmido apropiado, a continuación, añadir el reactivo de transfección TransPass D2, a continuación, añadir el reactivo de transfección TransPass V. Mezclar los componentes, así pipeteando arriba y hacia abajo con suavidad varias veces después de la adición de cada reactivo.
5. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos.
6. Durante la incubación, lavar las células una vez con 600 l de DMEM completo y añadir 450 l de DMEM completo a cada muestra.
7. Añadir 50 l de la mezcla de transfección complejos para cada muestra, lentamente y de forma gota a gota.
8. Incubar las muestras de la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.

SNAP-celular TMR estrella Etiquetado de células CHO-K1 transfectadas transitoriamente con pSNAP-ADRB2 y H2B-pSNAP:

1. Retire con cuidado los medios de comunicación complejos de transfección de cada muestra por medio de succión al vacío. Lavar las células dos veces con 600 l de completar F-12K y reemplazar los medios de comunicación en cada pozo con 600 l de completar F-12K.
2. Mix de medios tinte etiquetado mediante la adición de 995 l de completar F-12K y 51 l 0,6 mM SNAP-sustrato celular TMR-Star. La concentración final de SNAP-celular TMR-Star debe ser de 3 mm. Pipeta hacia arriba y abajo varias veces para mezclar después de la adición del substrato.
3. Retire con cuidado los medios de cultivo de las muestras y añadir 200 l de los medios de comunicación tinte de etiquetado a cada pocillo. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 30 minutos.
4. Mientras que las muestras se incuba, prepare la solución de Hoechst 33342 para la tinción nuclear de las muestras mediante la mezcla de 1 l de Hoechst 33342, trihidrocloruro, trihidrato (10 mg / ml de solución en agua, 16,2 mM solución; Invitrogen sondas moleculares) en 10 ml de completar F-12K .
5. Retire el papel de todas las muestras y añadir 600 l de la solución diluida de Hoechst para cada muestra. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 minutos.
6. Lávese las muestras tres veces con 600 l de completar F-12K.
7. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 30 minutos para permitir que fluoróforo no incorporadas a difundir fuera de las células.
8. Después de 30 minutos, cambiar los medios de comunicación en las muestras de células SNAP-una vez más y proceder a la imagen.
9. Imagen de las células utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 200M ApoTome fluorescentes.

Resultados representante

Figura 1. A continuación sealgunos resultados representativos de las imágenes fluorescentes por microscopía fluorescente estándar de vida COS-7 en células que expresan etiqueta SNAP-fusiones. Esta primera imagen muestra en vivo COS-7 células que expresan pSNAP-H2B (nuclear histonas) marcado con SNAP-celular TMR-Star. La construcción pSNAP-H2B se ha generado mediante la pSNAP-tag (m) del vector. Las células se marcaron con SNAP-celular TMR-Star durante 30 minutos y contrastados con Hoechst 33342 (azul) de los núcleos. La fluorescencia de color rosa muestra la superposición de fluorescencia de color rojo donde la proteína histona está presente, además de la fluorescencia azul que indica el núcleo. La expresión de la proteína H-2B es clara y fácilmente identificables.

Figuras 2 y 3. Estas dos imágenes siguientes show en vivo células COS-7 transfectadas transitoriamente con pSNAP-ADRβ2.
Las células fueron marcadas con SNAP-celular TMR-Star (rojo) y de contraste con Hoechst 33342 (azul). La construcción pSNAP-ADRβ2 se ha generado mediante la pSNAP-tag (m) del vector. Las células se marcaron con SNAP-celular TMR-Star durante 30 minutos y contrastados con Hoechst 33342 (azul) de los núcleos. La fluorescencia de color rojo indica la presencia de ADRB2 de la superficie celular receptor de la proteína de fluorescencia azul, mientras que identifica el núcleo.

Discusión

Hay algunas variables que afectan los resultados observados, tales como la intensidad del láser se centran, las capacidades del equipo, la lente utilizada, etc fotoestabilidad del fluoróforo determina la rapidez con la fluorescencia debe ser capturado antes de desaparecer.

Este método de etiquetado de proteínas es muy versátil y útil para muchas aplicaciones. Tecnologías de la etiqueta de SNAP-y CLIP etiquetas para el etiquetado específico de proteínas de fusión con sondas sintéticas permiten diversos aspectos de la función de las proteínas, incluyendo una variedad de procesos dinámicos en células vivas y en lisados ​​celulares. SNAP-, CLIP-, MCP y ACP-tag tecnologías proporcionan una versatilidad sencillez y extraordinaria a la imagen de las proteínas en células vivas y fijos y al estudio de las proteínas in vitro. La creación de una única construcción génica produce una proteína de fusión etiquetados capaz de formar un enlace covalente a una variedad de grupos funcionales, incluyendo fluoróforos, biotina, o de granos. La proteína de interés debe ser clonado y expresado una sola vez y después de la fusión se puede utilizar con una variedad de sustratos fluorescentes para numerosas aplicaciones posteriores, como el etiquetado de proteínas simultáneamente dentro de células vivas, localización de la proteína y el traslado, el pulso-caza experimentos, estudios de internalización del receptor , el etiquetado selectivo de la superficie celular, proteínas desplegable ensayos, la detección de proteínas en SDS-PAGE, citometría de flujo, de alto rendimiento de los ensayos de unión en placas de microtitulación, experimentos biosensor interacción, y FRET basado en ensayos de unión.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células CHO-K1	ATCC	CCL-61
F-12K sin suero
Portaobjetos con cámaras de cubreobjetos de borosilicato #1.5 Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155409	Lote: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihidrocloruro, trihidrato (solución 10 mg/ml en agua, solución 16,2 mM)	Invitrogen	H3570	470519
Microscopio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
Plásmido control pSNAP-ADBR2	New England Biolabs	N9178S	0010811
Plásmido control pSNAP-H2B	New England Biolabs	N9179S	0010811