En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Resumen

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

Resumen

Desentrañar la red de interacción de las moléculas

Protocolo

Microcontacto de impresión:

1. Recorta el campo de micropattern del sello PDMS con un bisturí
2. Lave el campo que contiene el micropattern por lavado con etanol (100%) y agua destilada.
3. Seque el sello PDMS con nitrógeno o argón.
4. Añadir 50 l de BSA-Cy5 solución de trabajo (0,67 mg / ml) en el sello PDMS, para que todo el campo micropattern está cubierto con la solución. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Lavar el campo micropattern lavándolo con tampón fosfato salino (PBS) y agua destilada.
6. Seque el PDMS con nitrógeno o argón.
7. Coloque el sello PDMS por su propio peso en medio de un revestimiento epóxico cubreobjetos y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en una placa de Petri.
8. Etiqueta de la posición de la marca de PDMS en la parte trasera del cubreobjetos y tira el sello de la diapositiva con una pinza.
9. Palo de una cámara de sello de hibridación seguro sobre el campo microcontacto impresos en el cubreobjetos. La etiqueta ayuda a localizar el centro del campo.
10. Pipeta de 60 estreptavidina l solución de trabajo (50 mg / ml) en la cámara de reacción e incubar la muestra durante 60 minutos a temperatura ambiente.
11. Lavar la muestra con 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y eliminarlo de forma simultánea en el segundo puerto con una bomba.
12. Pipeta de 60 l de anticuerpos con biotina solución de trabajo (10 mg / ml en PBS suplementado con 0,1% de Tween 20; "PBST") en la cámara de reacción e incubar durante 60 min a temperatura ambiente.
13. Lavar la muestra con 1 ml de PBST y luego 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y la eliminación de nuevo en el segundo puerto con una bomba.
14. Tienda de las superficies micropatterned en PBS en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las células están listas para la siembra.

La incubación de las células en la superficie micropatterned:

1. Crecen las células adherentes al 50% de confluencia en una placa de cultivo de 3 cm de tejido.
2. Separar las células que expresan proteínas cebo y la presa de intereses con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se centrifuga 5 min a 1.000 rpm.
3. Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en el medio de cultivo de acuerdo.
4. Centrifugar 5 min a 1.000 rpm.
5. Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en medio de cultivo apropiado.
6. Intercambio de la PBS de la cámara de reacción en el cubreobjetos micropatterned en un 60 l de la suspensión celular.
7. Crear una cámara húmeda empapando una gasa estéril con agua destilada y ponerlo en la placa de Petri para evitar que la muestra de la falta de agua.
8. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un _5% de CO2 la atmósfera en la superficie micropatterned.
9. Antes de analizar las células en el microscopio, el medio de intercambio por solución salina tamponada Hank s como Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +.}

Microscopía:

1. El cubreobjetos se coloca sobre un soporte adecuado y la morfología de las células se examinan bajo luz blanca.
2. La calidad de los BSA-Cy5 patrones está marcada por la excitación a 647 nm.
3. Micropatrones de presa de proteínas fluorescentes (GFP o YFP) se registran en 488 o 514 nm en reflexión interna total (TIR) ​​de excitación.

Los resultados representativos:

Si hay una interacción entre las proteínas diana en las células cultivadas en una superficie micropatterned, la presa seguirá la redistribución de cebo. El micropattern resultante puede ser visualizado por la etiqueta de fluorescencia de la proteína de la presa. Es importante destacar el contraste obtenido proporciona una medida directa de la fuerza de interacción (ver Figura 1). Por lo tanto, una simple evaluación de la interacción de dos proteínas es posible - sin necesidad de otro proceso de los datos primarios medidos.

Figura 1. Reordenamiento del cebo en la membrana de células plasmáticas en vivo en diferentes fuerzas de interacción. TIR imágenes de las células transfectadas con T24 (a) CD71-GFP en CD71-anticuerpo, CD4 (b) y YFP citosólica de CD4-anticuerpo y (c) GPI-DAF-GFP en microbiochips CD59-anticuerpo se muestran. Los datos son característicos de una fuerte (a), no (b) o de la interacción débil (c). (A) se reproduce a partir de (Weghuber et al., En prensa), (b) de (Schwarzenbacher et al., 2008).

Discusión

El video que acompaña muestra un método para la detección de interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática de las células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, en prensa). En principio, cualquier plataforma microscopía TIRF basado puede ser utilizado como sistema de lectura. Sólo cuando se desea una alta sensibilidad (por ejemplo, para la detección de moléculas individuales), los microscopios avanzados se requerirá. Para obtener los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial:

1. Tienda Cy5-de la solución madre en condiciones de oscuridad para evitar la decoloración del fluoróforo y preparar la BSA-Cy5 solución de trabajo poco antes de la impresión por microcontacto.
2. Tenga cuidado de no rayar la micropattern en el PDMS con la punta de la pipeta y se incuba la muestra en condiciones de oscuridad para evitar el blanqueo del fluoróforo.
3. Coloque el cubreobjetos sobre una gasa estéril para evitar la adherencia de la lámina de vidrio de la placa de Petri. Una vez que el sello de PDMS se ha adherido a la lámina de vidrio, no lo mueva.
4. Evite las burbujas de aire en la cámara de reacción e incubar la muestra en condiciones de oscuridad para evitar la decoloración del fluoróforo.
5. No permita que la muestra seca por más de 2 minutos para evitar la formación de cristales de sal.
6. Para el desprendimiento de las células no utilizan la tripsina, ya que se unirá al dominio extracelular de proteínas de la membrana hasta ahora expresados. Evitar la tripsina será útil para las proteínas con baja tasa de rotación para formar micropatrones inmediatamente después de fijación de las células en la superficie.
7. Controlar el número de células se incubaron en un microscopio y asegurarse de que las células no llegan a más de 30-50% de confluencia. Asegúrese de que las células se eliminan inmediatamente excesiva debido a la fijación rápida de las células en la superficie recubiertas de anticuerpos.
8. Sólo con diapositivas de alta calidad BSA-Cy5 patrones se pueden utilizar para su posterior análisis.
9. La expresión estable de la proteína fluorescente presa es preferible debido a un mayor número de células que pueden ser analizados por barrido.
10. Adecuado ajuste TIRF es indispensable para visualizar los patrones de fondo debido a la citosólica.

La técnica de micro-patrones ofrece varias posibilidades para el análisis de las interacciones proteína-proteína. En primer lugar, junto con la cuantificación de los locales, resolución espacial interacciones proteína-proteína también la detección de interacciones débiles o indirecta es posible sin el inconveniente de dar un alto número de falsos positivos o negativos. En segundo lugar, permite al investigador para analizar interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática de células vivas, lo cual es difícil de conseguir por métodos bioquímicos como la pantalla de dos híbridos. En tercer lugar el método permite la detección de interacciones presa-cebo que son moduladas por los cambios ambientales como la temperatura, la presencia de diferentes proteínas u otras moléculas o modificaciones posteriores a la traducción. Así, el ensayo permite moduladores de detección de un par de interacción dada en el contexto de las células vivas. Por otra parte, mediante la reducción de la densidad superficial del ligando de captura o el uso de ligandos monovalentes, el análisis del estado de reposo se hace posible. Por último, si suficientes plataformas de exploración se utilizan, el número de células analizadas es lo suficientemente alto como para satisfacer las demandas de alto rendimiento de las compañías farmacéuticas para la detección de drogas (Ramm, 2005).