Este protocolo describe un método general para llevar a cabo fotoconversión de proteínas fluorescentes en un microscopio láser confocal de barrido. Se describen los procedimientos para la fotoconversión de muestras de proteínas puried, así como de doble sonda óptica destacando en células vivas con mOrange2 y Dronpa.
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Artículo de método
Fotoconversión purificada de proteínas fluorescentes y de doble sonda óptica destacar en células vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Fotoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PM) son una clase de proteínas fluorescentes con "resaltador óptico" capacidad, lo que significa que el color de la fluorescencia se puede cambiar por la exposición a la luz de una longitud de onda específica. Destacando óptico no invasivo permite el marcado de una subpoblación de moléculas fluorescentes, lo que es ideal para el seguimiento de las células individuales u orgánulos.
Parámetros críticos para fotoconversión eficientes son la intensidad y el tiempo de exposición de la luz fotoconversión. Si la intensidad es demasiado baja, fotoconversión será lento o no ocurrir en absoluto. Por otro lado, demasiada intensidad o la exposición por mucho tiempo puede photobleach la proteína y por lo tanto reducir la eficiencia de fotoconversión.
Este protocolo describe un enfoque general de cómo configurar un microscopio láser confocal de barrido para aplicaciones fotoconversión pc-FP. En primer lugar, se describe un procedimiento para la preparación de muestras purificadas gota de proteínas. Este formato de la muestra es muy conveniente para estudiar el comportamiento fotofísicas de proteínas fluorescentes bajo el microscopio. En segundo lugar, vamos a utilizar la muestra de gota de proteínas para mostrar cómo configurar el microscopio en busca de fotoconversión. Y, por último, vamos a mostrar cómo realizar destacando óptica en células vivas, incluidos los de doble óptica con la sonda destacando mOrange2 y Dronpa.
Protocolo
1. Preparación de muestras de proteínas fluorescentes gota
Una muestra de la proteína fluorescente consiste en gotas de una emulsión de 1-octanol/water con la proteína fluorescente que residían en la fase acuosa. Esta emulsión se encuentra entre un portaobjetos de microscopio y un vaso de 22 mm cuadrados para cubrir las aplicaciones de la microscopía.
- Antes de tomar muestras de gotas fluorescentes proteína de los portaobjetos y cubreobjetos deben ser limpiados y recubiertos con un agente hidrófobo.
- Limpiar la cristalería por lavado de 5 minutos con acetona y dejar secar por aire. (Si lo desea, después de limpiar el vi....
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Discusión
La muestra purificada gota proteína fluorescente es un formato de muestra muy conveniente para la caracterización fotofísicas de proteínas fluorescentes, por ejemplo, para estudiar la cinética y la cinética de photobleaching fotoconversión. El volumen de gota muy pequeña (~ 20 picolitros) facilita photobleaching y experimentos fotoconversión, que puede ser difícil de realizar en los sistemas basados en la cubeta. Además, como se muestra aquí la muestra de gota es ideal para la creación de un microscopio confocal para .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Mike W. Davidson (Universidad Estatal de Florida) para proporcionar el plásmido de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM72048 (a DWP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Láminas para microscopio | VWR international | 48312-003 | |
| Cubreobjetos de 22 mm | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| metiltrimetoxisilano | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| Placas MatTek | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamina2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Referencias
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
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Reimpresiones y permisos
