Verwerking van insectenpoten voor fluorescentiemicroscopie: een methode om neuromusculaire structuren voor beeldvorming te behouden

Overview

Deze video beschrijft een methode om het drosophila volwassen been te ontleden, te repareren en te monteren, terwijl het neuromusculatuur intact blijft voor beeldvormingsanalyse.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Beendissectie en fixatie

1. Neem een glazen multi-well plaat en vul het juiste aantal putten met 70% ethanol. Voeg 15-20 CO₂-verdoofde vliegen (van beide geslachten en elke leeftijd) toe aan elke put en dep met een borstel de vliegen voorzichtig in de ethanoloplossing totdat de vliegen volledig onder water staan.
   OPMERKING: Deze stap is om de hydrofobiciteit van de nagelriem te verwijderen. Niet langer dan 1 minuut wassen, omdat dit de autofluorescentie van de nagelriem verhoogt.
2. Spoel de vliegen 3 keer met 0,3% nonionische oppervlakteactieve reinigingsmiddeloplossing in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de vliegen in deze oplossing minstens 10 minuten.
   OPMERKING: Benen zijn beter bevestigd bij het opnemen van wasmiddel, wat waarschijnlijk de penetratie van het fixatieve in het been zal verhogen.
3. Plaats een multi-well plaat op het ijs samen met een buis van 4% paraformaldehyde (PFA).
   OPMERKING: De bereiding van verse 4% PFA uit een 16% PFA ethanolvrije voorraadoplossing is van cruciaal belang.
4. Gebruik een tang om het hoofd en de buik van de vliegen te verwijderen zonder het thoracale segment of de benen te beschadigen.
   OPMERKING: Het verwijderen van de buik maakt het gemakkelijker om de vlieg vast te houden en de benen te ontleden.
5. Ontleed de benen van het thoracale segment met een tang en plaats de benen in de putten met 4% PFA. Duw hiervoor voorzichtig maar stevig op de coxa-thoraxverbinding met behulp van de punt van de fijne tang totdat het been losraakt.
6. Bevestig de poten 's nachts bij 4 ° C (in totaal ongeveer 20 uur) in 4% PFA.
7. Was de poten met 0,3% nonionische oppervlakteactieve reinigingsmiddeloplossing in 1x PBS, elk 5x gedurende 20 minuten.
8. Vervang de wasbuffer door het montagemedium. Houd het been ten minste een dag vóór de montage in het montagemedium om de volledige penetratie in het been mogelijk te maken.
   OPMERKING: Als het montagemedium zeer stroperig is, verdun het montagemedium dan tot 80% met 1x PBS, omdat de plotselinge verandering in viscositeit ervoor kan zorgen dat de nagelriem instort en de algehele structuur van het been beschadigt. Afhankelijk van de Gal4-driver kunnen vliegen tot aan de montage 1 tot 3 weken bij 4 °C in montagemedia worden bewaard.

2. Beenmontage

1. Plaats ongeveer 20 μL 70% glycerol aan de linkerkant van een microscoopschuif en dek af met een vierkante afdeklip van 22 x²² mm 2 (afbeelding 1A,B). Pipetteer ongeveer 10 μL montagemedium langs een lijn evenwijdig aan en op kleine afstand van de rechterrand van deze afdeklip. Voeg aan de rechterkant van de glijbaan nog eens 30 μL montagemedium toe (figuur 1C).
   OPMERKING: Bij het aanbrengen van een afdeklip over de poten (zie hieronder) zal het montagemedium zich voorzichtig onder de afdeklip en rond de poten verspreiden zonder ze te verplaatsen.
2. Til met een fijne tang het been van de oplossing en plaats het voorzichtig op het montagemedium in de buurt van de linker afdeklip. Doe hetzelfde voor elk been en lijn ze uit van boven naar beneden (figuur 1D).
   1. Til en breng de benen over in een druppel medium tussen beide uiteinden van de tang. Oriënteer de benen op twee manieren: uitwendige kant omhoog of omlaag.
3. Zodra alle poten (tot 6-8 poten kunnen worden gemonteerd) goed zijn uitgelijnd, plaatst u een tweede afdeklip over de benen zodat deze afdeklip iets rust op de eerder geplaatste afdeklip Figuur 1E om ruimte te maken tussen de afdeklip en het weefsel en om te voorkomen dat de benen beschadigd raken (Figuur 1G).
   OPMERKING: U kunt ook stickerputten of orthodontische was gebruiken om ruimte te creëren tussen de afdeklip en de glijbaan.
4. Gebruik een nagellak om de positie van de afdeklips in elke hoek vast te zetten (Figuur 1F).
   OPMERKING: Het weefsel is nu klaar om zich te verbeelden.

Representative Results

Figuur 1: Procedure voor het monteren van poten op microscoopglaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium