Overview
Denne videoen beskriver en metode for å dissekere gonader fra voksne C. elegans hermafroditter, noe som resulterer i vev som er egnet for immunstaining og fluorescerende avbildning.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Gervaise og Arur, Spatial og Temporal Analyse av Active ERK i C. elegans Germline. J. Vis. Utt. (2016).
1. Disseksjon av voksne ormer for å skaffe gonader
- Velg 100 - 150 WT (N2) eller ønsket genotype av ormer på ønsket og spesifikk utviklingsstadium (L1, L2, L3, L4, voksen, etc.) i 100 μL M9 buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fyll mikrosentrifugerøret med 900 μL M9 buffer (se Materialtabell). Sentrifuger rørene på 1000 x g i en mikrosenter i 1 min ved omgivelsestemperatur.
- Fjern forsiktig 900 μL av M9-bufferen og kast den. Fjern bufferen under et dissekeringsmikroskop for å sikre at ormene ikke fjernes ved et uhell.
- Gjenta trinn 1.2 - 1.3 to ganger til med fersk M9-buffer hver gang. Dette sikrer at eventuelle bakterier som ble båret over med ormene, effektivt vaskes bort.
- Etter den endelige vasken fjern 900 μL M9 buffer fra røret og kast.
- Overfør de resterende 100 μL M9-bufferen som inneholder 100 - 150 ormer med en 200 μL-mikropipettespiss til en flat klokkefat i bunnglass. Påse at mikropipettespissen kuttes ved 10 μL-merket før bruk. Ikke kutting av spissen vil resultere i skjæring av ormene.
- Tilsett 1 - 3 μL 0,1 M levamisol i glassklokkefatet som inneholder ormene i M9-bufferen. Virvle forsiktig levamisolen og M9 for å gjøre det mulig å blande til ormene slutter å bevege seg.
MERK: Levamisolbestandene kan oppbevares ved -20 °C for langtidslagring. Her bruker du den høyere konsentrasjonen på 1 - 3 mM enn det som er beskrevet i litteratur23 av 0,2 - 0,25 mM levamisol for å oppnå raskt tap av mobilitet hos dyrene. Hvis dyrene flay rundt for lenge i væske suspensjon, kan de resulterende mønstrene av dpERK i gonadene være variable (på grunn av stress eller mangel på ernæring eller begge deler). Mer reproduserbare fargemønstre er oppnådd med 1 - 3 mM levamisol for disseksjon. - Fest to 25 G nåler til to 1 ml sprøyter (størrelsen på sprøyten spiller ingen rolle, nålens måler er kritisk). Plasser én sprøyte i hver hånd (figur 1).
- Under et dissekerende mikroskop plasserer du hver nål under og over hver orm som vist i figur 1 og legger et fint kutt på ormen nær den andre faryngealpæren i en sakslignende bevegelse. Etter ett kutt i ormen går videre til neste dyr til alle dyrene i parabolen er kuttet minst en gang.
MERK: Vær oppmerksom på at trinn 1.8 - 1.9 er tidssensitive. Disseker alle ormer i parabolen på under fem minutter for et reproduserbart dpERK-mønster. Lengre disseksjonstider vil føre til at dpERK-signalet slås av, spesielt i sone 1. Juster antall ormer per runde med disseksjon (dvs.50 ormer vs. 150) om nødvendig for å holde seg i den tildelte tidsrammen.- I tilfelle en ekstrudert gonad ikke er synlig under disseksjonen, ikke prøv et nytt kutt i samme dyr. Vanligvis vil det bare skjære dyret og ikke resultere i ekstrudering av gonaden. Gå i stedet videre til neste dyr. Ormer der gonadene ikke ekstruderer, vises som sådan på lysbildene som vil bli laget i del 6 og kan ignoreres under bildebehandling
MERK: Gjennom alle disseksjons- og behandlingstrinnene er det viktig å huske på at gonad vil forbli festet til kroppen / slaktkroppen. Ikke tving gonad og kroppen fra hverandre med nålen. Ofte kan en avvikende tåre i gonadalvevet i et forsøk på å kutte gonad fra kroppen føre til falske antistoffsignaler. Kroppen/slaktkroppen kan ignoreres under bildebehandlingstrinnene, og bare gonad avbildes. I tillegg kan tarmcellene noen ganger også fungere som interne kontroller / somatiske kontroller for antistoffet som blir analysert.
- I tilfelle en ekstrudert gonad ikke er synlig under disseksjonen, ikke prøv et nytt kutt i samme dyr. Vanligvis vil det bare skjære dyret og ikke resultere i ekstrudering av gonaden. Gå i stedet videre til neste dyr. Ormer der gonadene ikke ekstruderer, vises som sådan på lysbildene som vil bli laget i del 6 og kan ignoreres under bildebehandling
Figur 1: Demonstrasjon av nåleposisjoner under disseksjoner. Venstre: Fotografi av en disseksjon i gang. Høyre: Nåleposisjoner med referanse til ormen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
Clinical bench top centrifuge | |||
*M9 solution | |||
Levamisole | Sigma | L9756 | |
*M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. |