Ensayo de puntos de luz: un método para investigar el comportamiento fototáctico de Drosophila

Resumen

Fuente: Sun, Y., et al. Ensayo basado en puntos de luz para el análisis de la fototaxis de larvas de Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Las larvas de Drosophila son sensibles a la luz y responden a los cambios en la luz circundante. Este video describe un ensayo que evalúa su capacidad para evitar la luz, llamado ensayo de punto de luz. El protocolo presentado muestra cómo configurar el ensayo con un LED de luz azul y muestra cómo registrar el comportamiento del animal en respuesta al encuentro con la luz.

Protocolo

Este texto de protocolo es un extracto de Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Configuración del sistema de imágenes

1. Sujete una cámara web de alta resolución con un clip de hierro, a unos 10 cm por encima del punto de luz en el escritorio (Figura 1).
2. Ajuste la orientación de la lente de la cámara hacia el escritorio. Conecte la cámara a una computadora a través de una interfaz USB.
3. Coloque una placa de agar en el escritorio justo debajo de la cámara.
4. Abra el software "Amcap9.22" en la computadora con Windows 7, y el punto de luz se mostrará automáticamente en la ventana de AMcap. Mueva la cámara ligeramente hacia la izquierda o hacia la derecha para asegurarse de que el punto de luz esté cerca del centro de la ventana. Asegúrese de que la cámara no bloquee la trayectoria de la luz. El punto de luz debe ser completo y redondo.
   NOTA: El software se puede encontrar en http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fije un filtro de paso de banda de 850 nm ± 3 nm con un clip a 5-7 mm justo debajo de la cámara.
   NOTA: El diámetro del filtro es de aproximadamente 2,5 cm y la lente de la cámara tiene menos de 1 cm de diámetro, por lo que el filtro puede cubrir el campo visual de la cámara. Con el filtro debajo de la cámara, el punto de luz no debe verse en la ventana de AMcap.
6. Coloque tres LED generadores de luz infrarroja (longitud de onda central = 850 nm) de manera uniforme alrededor de la placa de agar. Cada LED debe estar a unos 5 cm del borde de la placa de agar, y la cara de la lente del LED debe estar en un ángulo de 70° hacia abajo hacia la placa de agar. Conecte los LED a la alimentación a través del convertidor de CA a CC.
   NOTA: Es mejor fijar las posiciones y los ángulos de los LED de luz infrarroja para garantizar la consistencia del brillo del campo en varios ensayos experimentales y facilitar el procesamiento de video posterior.
7. Coloque una pizarra negra entre la computadora y el dispositivo. Reduzca el brillo de la pantalla de la computadora para evitar que la luz de la pantalla de la computadora afecte el experimento><. NOTA: Mantenga el entorno oscuro cuando mida la longitud de onda o la intensidad de la luz.

2. Ajuste de los parámetros de la imagen

1. En el menú del software AMcap, seleccione Opciones | Dispositivo de video | Formato de captura y establezca el tamaño de píxel del vídeo capturado en 800 x 600 y la velocidad de fotogramas en 60 fps.
2. Retire el filtro de debajo de la cámara, coloque una regla debajo de la cámara y ajuste el enfoque de la cámara para que la línea de escala sea clara y paralela al ancho del campo de visión del video.
3. Haga clic en Capturar | Configuración | Captura de vídeo Para seleccionar la ruta de guardado, haga clic en Iniciar grabación, grabe la distancia real correspondiente a 600 píxeles y calcule la relación de cada píxel con la distancia real.

3. Grabación de vídeo del comportamiento de evitación de la luz

1. Mantenga una temperatura de 25,5 °C durante todos los experimentos. Controle la temperatura de la habitación con un acondicionador de aire si es necesario. Mantenga la humedad constante al 60% con un humidificador.
2. Tome un breve video de la posición del punto de luz llamado "lightarea1". Luego, mueva el filtro de 850 nm ± 3 nm hacia atrás para cubrir la lente de la cámara.
   NOTA: Al grabar el comportamiento de las larvas, la lente de la cámara está cubierta por el filtro de 850 nm ± 3 nm para que el punto de luz no se muestre en el video. El punto de luz se puede reconstruir en videos con larvas posteriormente con Matlab. No cambie la posición de la cámara y evite cambiar la relación de cada píxel con la distancia real medida en el paso 2.3.
3. Encienda una luz (es decir, la luz de una habitación) lejos del dispositivo experimental. Baje la luz lo más bajo posible, siempre y cuando las larvas se puedan ver claramente con los ojos. Saque las larvas del medio de cultivo con una cuchara, recoja suavemente una larva de tercer estadio y lávela con agua destilada. Tenga cuidado de lavar las larvas una a la vez para evitar la interferencia del hambre. Un solo experimento requiere al menos 20 larvas.
4. Transfiera la larva al centro de la placa de agar colocada debajo de la cámara durante el paso 1.3. Retire suavemente el exceso de agua de la larva con un cepillo o use papel secante para eliminar el agua de la larva y evitar el reflejo de la luz debajo de la lente. Apague la luz de la habitación y permita que la larva se aclimate durante 2 minutos en un ambiente oscuro.
5. Encienda la luz LED para generar luz infrarroja y cepille suavemente la larva hasta el centro del plato. Cuando la larva comience a arrastrarse en línea recta, gire la placa para que la larva se dirija hacia el punto de luz. Asegúrese de que se arrastre directamente desde el principio, o de lo contrario es posible que no obtenga acceso al punto de luz.
6. Haga clic en Capturar | Configuración | Captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado y, a continuación, haga clic en Iniciar grabación para grabar. Permita que la larva se arrastre hacia el punto de luz, ingrese al punto de luz y luego abandone el punto de luz hasta que esté casi fuera del campo de visión. Haz clic en Detener grabación. Si la larva se aleja del punto de luz antes de acercarse, haga clic directamente en Detener grabación.
7. Aleje el filtro de la cámara. Tome un video corto de la posición del punto de luz llamado "lightarea2" y compárelo con "lightarea1" para asegurarse de que la posición del punto de luz no cambie. Si se observa un cambio de posición evidente, descarte los datos.

Resultados

Figura 1: Montaje experimental. (A) Representación esquemática de la configuración para el ensayo de fototaxis rápida de larvas basado en puntos de luz. Las líneas azules representan las trayectorias de la luz visible utilizada como estimulación visual, y las líneas rojas representan las trayectorias de la luz infrarroja. Las flechas indican la dirección de la luz. El filtro de paso de banda de 850 nm pe...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LED generador de luz infrarroja de 850 nm ± 3 nm	Thorlabs, Estados Unidos	PM100A	Sensores compatibles: fotodiodo y térmico Rango de potencia ópticaa: 100 pW a 200 W Rango de longitud de onda del sensor disponiblea: 185 nm-25 μm Frecuencia de actualización de la pantalla: 20 Hz Ancho de banda: DC-100 kHz Rango del sensor de fotodiodob: 50 nA-5 mA Rango del sensor de termopilab: 1 mV-1 V
Convertidor de CA a CC	Thorlabs, Estados Unidos	S120VC	Tamaño de apertura: Ø9.5 mm Rango de longitud de onda: 200-1100 nm Rango de potencia: 50 nW-50 mW Tipo de detector: Fotodiodo de Si (UV extendido) Linealidad: ±0.5% Incertidumbre de mediciónc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
Filtro de paso de banda	Thorlabs, Estados Unidos	DC2100	Rango de corriente del LED: 0-2 A Resolución de corriente del LED: 1 mA Precisión de corriente del LED: ±20 mA Voltaje directo del LED: 24 V Rango de frecuencia de modulación: 0-100 kHz onda sinusoidal Modulación: Arbitraria
Luz azul LED colimada	ELP, China	USBFHD01M	Resolución máx.: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Consola compacta de medidor de potencia	Ocean Optics, EE. UU.	USB2000+(RAD)	Dimensiones: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Peso: 190 g Detector: Sony ILX511B (matriz CCD de silicio lineal de 2048 elementos) Rango de longitud de onda: 200-850 nm Tiempo de integración: 1 ms – 65 segundos (20 segundos típicos) Rango dinámico: 8,5 x 10^7 (sistema); 1300:1 para una sola adquisición Relación señal-ruido: 250:1 (señal completa) Ruido oscuro: 50 RMS cuentas Rejilla: 2 (250 – 800 nm) Ranura: SLIT-50 Lente colectora del detector: L2 Clasificación de pedidos: OFLV-200-850 Resolución óptica: ~2.0 nm FWHM Luz parásita: <0,05% a 600 nm; <0.10% a 435 nm Conector de fibra óptica: SMA 905 a fibra de un solo hilo con apertura numérica de 0,22
Controlador LED de alta potencia	Minhongshi, China	MHS-48XY	Voltaje de trabajo: DC12V Longitud de onda central: 850 nm
Cámara web de alta resolución	Thorlabs, Estados Unidos	MWWHL4	Color: Blanco cálido Temperatura de color correlacionada: 3000 K Corriente de prueba para la potencia típica del LED: 1000 mA Corriente máxima (CW): 1000 mA Ancho de banda (FWHM): N/A Potencia eléctrica: 3000 mW Ángulo de visión (ángulo completo): 120° Tamaño del emisor: 1 mm x 1 mm Vida útil típica: >50 000 h Temperatura de funcionamiento (sin condensación): 0 a 40 °C Temperatura de almacenamiento: -40 a 70 °C Grupo de Riesgoa: RG1 – Grupo de Bajo Riesgo
LED Blanco Cálido	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Ancho de banda: 22±3nm Transmitancia máxima: 80% Longitud de onda central: 850 nm±3 nm
espectrómetro	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap es una aplicación de captura de imágenes fijas y videos con funciones avanzadas de vista previa y grabación. Es una aplicación de escritorio diseñada para computadoras con Windows 7 SP1 o posterior. La mayoría de los dispositivos compatibles con Video para Windows y DirectShow son compatibles, ya sean cámaras web baratas o tarjetas de captura de video avanzadas.
Sensor de potencia de fotodiodo estándar	Super Dragón, China	YGY-122000	Entrada: CA 100-240V ~ 50 / 60Hz 0.8A Salida: DC 12V 2A
Sensor de potencia térmica	Thorlabs, Estados Unidos	M470L3-C1	Color: Azul Longitud de onda nominala: 470 nm Ancho de banda (FWHM): 25 nm Corriente máxima (CW): 1000 mA Voltaje directo: 3.2 V Potencia eléctrica (máx.): 3200 mW Tamaño del emisor: 1 mm x 1 mm Vida útil típica: 100 000 h Temperatura de funcionamiento (sin condensación): 0 a 40 °C Temperatura de almacenamiento: -40 a 70 °C Grupo de Riesgob: RG2 – Grupo de Riesgo Moderado
Sensor de potencia térmica	Thorlabs, Estados Unidos	S401C	Rango de longitud de onda: 190 nm-20 μm Rango de potencia óptica: 10 μW-1 W (3 Wb) Tamaño de apertura de entrada: Ø10 mm Área del detector activo: 10 mm x 10 mm Densidad de potencia óptica máxima: 500 W/cm2 (promedio) Linealidad: ±0.5%