光スポットアッセイ: ショウジョウバエ の光性挙動を調べる方法

Overview

ショウジョウバエ の幼虫は光に敏感で、周囲の光の変化に反応します。このビデオでは、光スポットアッセイと呼ばれる光を避ける能力をテストするアッセイについて説明します。注目のプロトコルは、青色光LEDでアッセイを設定する方法を示し、光の出会いに応答して動物の行動を記録する方法を示しています。

Protocol

このプロトコルテキストは、Sunら、ショウジョウバエ幼虫フォトタキシスの分析のためのライトスポットベースのアッセイ、J.Vis. Exp.(2019)からの抜粋です。

1. イメージングシステムのセットアップ

1. 高解像度の Web カメラを、デスクトップのライト スポットの上に約 10 cm 上の鉄クリップでクランプします (図 1)。
2. カメラレンズのデスクトップ方向を調整します。USB インターフェイスを介してカメラをコンピュータに接続します。
3. デスクトップ上の寒天プレートをカメラの真下に置きます。
4. Windows 7搭載のコンピュータで「Amcap9.22」ソフトウェアを開くと、ライトスポットが自動的にAMcapのウィンドウに表示されます。カメラを少し左右に動かして、ライト スポットが窓の中心付近に位置するようにします。カメラがライトパスをブロックしていないことを確認します。ライトスポットは完全かつ丸い必要があります。
   注:ソフトウェアは http://amcap.en.softonic.com/にあります。
5. カメラのすぐ下に5-7 mmのクリップを付けて850nm±3 nmのバンドパスフィルタを固定します。
   注: フィルターの直径は約2.5cmで、カメラレンズの直径は1cm未満なので、フィルターはカメラの視野を覆うことができます。カメラの下のフィルターでは、ライト スポットは AMcap のウィンドウに表示されません。
6. 寒天板の周りに3つの赤外線光発生LED(中心波長=850nm)を均等に配置します。各LEDは寒天プレートの端から約5cm離れ、LEDのレンズ面は寒天プレートに向かって70°下向きにする必要があります。AC-DCコンバータを介してLEDを電源に接続します。
   注: 赤外線 LED の位置と角度を固定して、さまざまな実験でフィールドの明るさの一貫性を確保し、後でビデオ処理を容易にする方が良いでしょう。
7. コンピュータとデバイスの間に黒いボードを置きます。コンピュータ画面の明るさを設定して、コンピュータの画面ライトが実験に影響を与えないようにします。
   注: 光の波長や強度を測定する場合は、環境を暗く保ちます。

2. イメージングのパラメータの設定

1. AMcap ソフトウェアのメニューで、[ オプション] を選択 | ビデオ デバイス | キャプチャ形式を使用し、キャプチャしたビデオのピクセル サイズを 800 x 600、フレーム レートを 60 fps に設定します。
2. カメラの下からフィルターを取り外し、カメラの下にルーラーを置き、カメラの焦点を調整して、スケールラインを透明にし、ビデオの視野の幅に平行にします。
3. [キャプチャ||の設定ビデオキャプチャを使用して保存パスを選択し、[記録の開始] をクリックし、600 ピクセルに対応する実際の距離を記録し、各ピクセルの実際の距離に対する比率を計算します。

3. 光回避行動のビデオ録画

1. すべての実験を通して25.5 °Cの温度を維持する。必要に応じて、エアコンで室温を制御します。加湿器で湿度を60%に常に保ちます。
2. ライトスポット位置の短いビデオを撮る"ライトエリア1"。次に、カメラレンズを覆うために850nm±3 nmフィルタを戻します。
   注: 幼虫の挙動を記録する場合、カメラレンズは850 nm±3 nmフィルタで覆われ、光のスポットがビデオに表示されません。ライトスポットは、後でMatlabと幼虫とビデオで再構築することができます。カメラの位置を変更せず、各ピクセルの比率とステップ 2.3 で測定した実際の距離を変更しないようにします。
3. 実験装置から遠く離れたライト(つまり部屋の光)をオンにします。幼虫が目ではっきりと見える限り、できるだけ低く光を下ろしてください。幼虫を培地からスプーンで取り出し、第3のインスター幼虫をそっと摘み取り、蒸留水できれいに洗います。飢餓による干渉を避けるために、幼虫を一度に1つずつ洗うように注意してください。1回の実験では、少なくとも20頭の幼虫が必要です。
4. 幼虫をステップ1.3の間にカメラの下に置かれた寒天プレートの中心に移します。ブラシで幼虫から余分な水をそっと取り除くか、ブロッティングペーパーを使用して幼虫から水を取り除き、レンズの下の光の反射を防ぎます。室内の明かりを消し、幼虫が暗い環境で2分間順応するようにします。
5. LEDライトを点灯して赤外線を発生させ、幼虫をプレートの中央までそっと磨きます。幼虫がまっすぐ這い始めると、プレートを回転させて幼虫の頭を光のスポットに向かわせてください。最初からまっすぐクロールするか、ライト スポットにアクセスできない場合があることを確認します。
6. [キャプチャ||の設定ビデオキャプチャを使用して保存パスを選択し、[記録を開始する] をクリックします。幼虫が光のスポットに向かって這うようにし、光のスポットに入り、光のスポットをほぼ視野から外れるまで残します。[録画の停止]をクリックします。幼虫が近づく前に光のスポットから離れた場合は、[録音を停止] をクリックします。
7. フィルターをカメラから離します。ライトスポットの位置を「lightarea2」と呼ぶ短いビデオを撮り、それを「ライトエリア1」と比較して、ライトスポットの位置が変更されないようにします。位置の変化が明らかな場合は、データを破棄します。

Representative Results

図1:実験的なセットアップ(A)光スポットベースの幼虫高速光タクシーアッセイのセットアップの模式図。青い線は視覚刺激として使用される可視光の経路を表し、赤い線は赤外線の経路を表します。矢印はライトの方向を示します。850 nmバンドパスフィルタは赤外線を通過させますが、可視光を遮断します。(B)ライトスポットアッセイのセットアップの画像。画像は、より良い可視化のために光条件下で撮影されたことに留意すべきである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%