Artículo de método

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

DOI:

10.3791/2021

20 de julio de 2010

En este artículo

Resumen

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Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Resumen

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Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es extremadamente útil para la visualización de los compartimentos microglial, subcelular oligodendrocíticos, astrocitos y neuronas (las dendritas, la espina dendrítica, axón, axón terminal, pericarion), así como sus organelos intracelulares y el citoesqueleto, en el sistema nervioso central en alta resolución espacial. En combinación con TEM, pre-incrustación inmunocitoquímica permite la discriminación de los elementos celulares con algunos rasgos distintivos y los criterios de identificación (por ejemplo, la microglia perikarya y procesos, cuando se utiliza un anticuerpo contra el marcador de microglia específicos Iba1 (molécula ionizada de unión de calcio adaptador 1, tal como se presenta aquí)), la identificación de los contenidos de neurotransmisores de los elementos celulares (por ejemplo, serotoninérgicos) y su localización ultraestructural de las proteínas solubles o de membrana (por ejemplo, 5 HT1A y los receptores de EphA4). Aquí se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de ratones con acroleína fijador, la eliminación y la sección del cerebro, así como inmunoperoxidasa-tinción Diaminobencidina (DAB), la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen de TEM. Cuando se realiza con rigor, esta técnica proporciona un excelente compromiso entre la conservación óptima ultraestructurales y detección inmunohistoquímica.

Protocolo

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1. Los animales fueron perfundidos

  1. El día antes de la perfusión, preparar:
    - 2 L de tampón fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) y 1 l de sodio fosfato (PBS, 0,9% de NaCl en 50 mM PB, pH 7,4) con agua destilada. Guarde el PBS y 1 litro de PB a 4 ° C. Estos serán utilizados para la perfusión y la inmunocitoquímica pre-inclusión.
    - 1 litro de 4,0% de paraformaldehído (PFA, pH 7,4), la solución de fijación, que permitirá a la perfusión de 6 ratones. A tal efecto, calentar 1 L de PB en una campana extractora. Pesar 40 g de paraformaldehído granular (PFA) y se vierte en la solución de PB cuando llega a 60 ° C. Cuando la solución es clara, con la PFA comple....

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Discusión

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Aquí hemos descrito un protocolo de preparación de tejido ratón cerebro para microscopía immunoelectron que proporciona un excelente compromiso entre conservación óptima ultraestructurales y detección inmunocitoquímicas, cuando los procedimientos son rigurosamente realizado.

Combinado con TEM, este método permite distinguir elementos celulares con pocos características distintivas y criterios identificación. En particular, el tinción inmunoperoxidasa-DAB de Iba1 permite identificar microglia.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Damos las gracias a Shao-Ming Lu y A. Harris Gelbard para el uso de una bomba peristáltica y vibratome, así como Karen L. Bentley y Schneider Gayle en el Fondo para el núcleo Microscopio Electrónico de Investigación de la Universidad de Rochester Medical Center para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, y la Fundación Alfred P. Sloan de AKM. M.-È.T. es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral.

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Materiales

* Siempre se debe trabajar bajo una campana de humos y usar guantes de nitrilo al manipular la acroleína, paraformaldehído, y el osmio y también debe disponer de sus residuos adecuadamente.

Referencias

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  1. Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
  2. Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin ....

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