1. Preparación del homogeneizado de tejidos
- Los tejidos resecados por disección (tejido maligno y normal resecado desde el quirófano) se encuentran en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Los fragmentos tumorales, NANT (tomados a la mayor distancia posible del tumor) y tejido normal se procesan de forma rutinaria dentro de 1 a 3 horas después de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 utilizando procedimientos de bioseguridad estándar para tejidos humanos. En la Figura 1 se ilustra un diagrama de flujo del protocolo.
- Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumoral) y medir la longitud, la anchura y la altura (longitud x anchura x altura). Este es un paso importante para la posterior normalización de las subpoblaciones celulares, el ARN extraído, etc.
nota: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000mm3 sin grasa si es posible.
- Imprima el fragmento del tumor en un portaobjetos de vidrio para la tinción de H&E para verificar que el tejido es realmente parte del tumor.
- Para ello, presione un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre el fragmento tumoral y ejerza una presión suave con los dedos durante unos segundos.
- Fije el portaobjetos con isopropanol durante 2 minutos seguido de un paso de lavado en agua. Contratiñir el tejido durante 30 segundos con hematoxilina de Mayer.
- Lave el portaobjetos en seis baños de agua. Tinción en Phloxine B 2% durante 15 seg.
- Lavar en un baño de agua seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua.
- Incubar en isopropanol durante 1 min y escurrir. Claro en dos baños de xileno.
- Montaje con medio de montaje a base de xileno. Examinar la celularidad del tumor (Figura 2).
nota: Principalmente, las células tumorales se adhieren al portaobjetos impreso: las células estromales, linfoides o adiposas rara vez permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2).
- Coloque el fragmento de tejido en una pequeña placa de cultivo que contenga 1 ml del medio de células hematopoyéticas sin suero químicamente definido (en lo sucesivo, medio) a temperatura ambiente y córtelo en trozos pequeños (~ 1 - 2 mm2) con un bisturí estéril.
- Transfiera todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo C disociador mecánico.
- Enjuague la placa de Petri y el bisturí con 2 ml de medio con una pipeta Pasteur y añádalo al tubo C (volumen de medio para disociación = 3 ml).
- Utilice el programa disociador mecánico A.01 para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una suspensión unicelular. Coloque el tubo C en el aparato y ejecute el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 segundos).
nota: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado para el tejido mamario humano, otros tumores o tipos de tejido pueden necesitar usar un programa diferente y deben probarse primero.
- Retire el tubo C del aparato y decante el homogeneizado directamente en un filtro de células de 40 μm asentado sobre un tubo de 50 ml. Utilizando la misma pipeta Pasteur que en el paso 1.6, transfiera el líquido que quede en el tubo C al filtro de células.
- Transfiera el líquido filtrado a un tubo de 15 ml con una punta de micropipeta de 1 ml. Guarde temporalmente el filtro de células y su tubo de 50 ml.
- Enjuague el tubo C con 3 ml adicionales de medio y transfiéralo, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur que en el paso 1.6, al filtro de células que aún está asentado en el tubo de 50 ml. Exprimir la cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido no homogeneizado en el tubo de 50 ml moviéndolo suavemente alrededor del colador con una pipeta Pasteur limpia o una punta de 1 ml que posteriormente se desecha para evitar contaminar el eluido.
- Coloque el colador de células boca abajo en el tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido no homogeneizado vuelva a caer en el tubo C.
- Vuelva a homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01.
- Verter este segundo homogeneizado a través del filtro de células asentado en el tubo de 50 ml, enjuagar de nuevo el tubo C con 3 ml de medio (como en el paso 1.10) y transferir con la pipeta Pasteur al filtro de células asentado en el tubo de 50 ml exprimiendo de nuevo una cantidad máxima de líquido del tejido conectivo residual atrapado en el filtro de células.
- En este punto, hay un volumen de ~2,5 ml en el tubo de 15 ml y de ~9 ml en el tubo de 50 ml.
2. Separación del sobrenadante tisular y las células
- Centrifugar los homogeneizados en los tubos de 15 ml y 50 ml durante 15 min a 600 x g a temperatura ambiente.
- Decantar el SN del tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 °C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o SN de tejido normal (volumen final 2,5 ml) se clarifica posteriormente y se alícuota antes de su almacenamiento a -80 °C para futuros análisis (véase más adelante).
- Deseche el sobrenadante del tubo de 50 ml.
- Vuelva a suspender suavemente ambos gránulos celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero rompa suavemente el pellet de la celda en ambos tubos (golpeando el tubo sobre una superficie dura). Vuelva a suspender el pellet de celda suelta en el pellet de 50 ml con 500 μl de medio y transfiera esta suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspender el segundo pellet. Repita este paso una vez con los segundos 500 μl de medio para obtener la máxima recuperación de las células.
- Transfiera 10 μl de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 μl de azul de tripano (dilución 1:1) y cuente el número de células viables con un hemocitómetro.
nota: En este punto, una fracción de la suspensión celular también se puede analizar mediante citometría de flujo para evaluar el tamaño de la célula, la granularidad y, si se desea, un número limitado de marcadores de subpoblación para una evaluación más precisa de la distribución celular relativa en el homogeneizado antes de un análisis o experimentación extensos. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan el marcaje de CD45 para la normalización de subpoblaciones.
- Granular las células por centrifugación a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT o tejido normal ahora están listas para una mayor purificación o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan el mismo día de la cirugía.
nota: Para el análisis por citometría de flujo, pero no para la clasificación celular, los glóbulos rojos residuales deben lisarse después del marcaje de anticuerpos añadiendo 0,4 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos al pellet de células, vórtice inmediatamente durante 1 segundo e incubando un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente (protegidos de la luz) antes del análisis.
3. Clarificación del sobrenadante tisular
- Centrifugar los tubos de 1,5 ml con tejido SN a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar ni alterar el pellet. Transfiera a un tubo (o tubos) limpios según el número y el volumen de alícuotas deseados.
- Almacene el sobrenadante a -80 °C para su uso futuro.
