Preparación de muestras para metabolómica: un método para preparar muestras celulares para el perfil de metabolitos

Abstract

Fuente: Zhao, Y. C. et. al., Biología de sistemas de la regulación metabólica por la señalización de receptores de estrógeno en el cáncer de mama. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe una técnica de preparación de muestras de células de cáncer de mama para el perfil de metabolitos. Las células de cáncer de mama se tratan con estradiol, que se une al receptor de estrógeno alfa y provoca cambios en la composición de los metabolitos.

Protocol

1. Preparación de muestras de ensayo metabolómico

1. Cultivo y tratamiento celular
   1. Siembra 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento. Para cada tratamiento, prepare tres muestras. Utilice dos placas en cada muestra para recibir suficientes células para la detección. El día 3, retire el medio y agregue 5 ml de medio fresco con o sin ^10-8 M de estradiol o E2 a las células. Trate las células durante 24 horas (37 °C en atmósfera humidificada con 5% de_CO2).
2. Recogida de muestras
   1. Agregue 5 ml de 1x PBS helado a la placa, aspire el PBS después de inclinar brevemente la placa varias veces. Repita dos veces y elimine la mayor cantidad posible de PBS después del último lavado.
   2. Añadir 750 μl de acetona prefría a cada placa y raspar las células. Combine las células de acetona de dos placas en un tubo de 2 ml con hielo.
   3. Recuento de células para la normalización
      1. Para cada tratamiento, utilice dos placas adicionales para la cuantificación de células. Para desacoplar las células de la placa, añada 2 ml de tampón HE (1x HBSS, 10 mM de HEPES, NaHCO₃ al 0,075% y 1 mM de EDTA) en cada placa e incube durante 5 min.
      2. Recoja y mezcle bien las células pipeteando las células en el tampón HE. Use un total de 20 μl de solución de células para contar el número de células con un hemocitómetro.
3. Almacene las muestras a -80 °C antes de enviarlas al centro de metabolómica para identificar y cuantificar los metabolitos mediante análisis de cromatografía de gases, espectrometría de masas (GC-MS).