Comparativo In vivo Estudio de la gp96 adyuvante de la rana Xenopus laevis</em

Resumen

La rana Xenopus laevis Ofrece una atractiva alternativa de animales no mamíferos modelo para explorar la capacidad de la proteína de choque térmico, tales como la gp96, para promover el antígeno específico de células T CD8. Se presentan métodos para el estudio In vivo Facilitación de presentación cruzada de antígenos de la piel y los tumores de gp96.

Resumen

Hemos desarrollado en el Xenopus laevis un único anfibio de animales no mamíferos modelo para estudiar la capacidad de ciertas proteínas de choque térmico (HSP), tales como la gp96, para facilitar la presentación cruzada de antígenos carabina y obtener respuestas T innata y adaptativa de la célula. Xenopus rechazo del injerto de piel proporciona una plataforma excelente para estudiar la capacidad de gp96 para obtener clásico MHC de clase Ia (clase Ia) limita las respuestas de células T. Además, el sistema modelo Xenopus también ofrece una alternativa atractiva a los ratones para explorar la capacidad de gp96 para generar respuestas frente a los tumores que se han reducido regulado su clase Ia moléculas para eludir la vigilancia inmune. Recientemente, hemos desarrollado un ensayo de células de la transferencia adoptiva de clones Xenopus utilizando leucocitos peritoneales como células presentadoras de antígeno (APC), y ha demostrado que puede gp96 primer T CD8 respuestas de las células in vivo contra los antígenos de histocompatibilidad menores piel, así como contra el tumor del timo Xenopus 15 / 0 que no expresan moléculas de clase I bis. Se describe aquí la metodología consistió en llevar a cabo estos ensayos incluida la transferencia de la obtención, pulso y adoptivos de leucocitos peritoneales, así como el injerto de piel y los ensayos de trasplante del tumor. Además también estamos describiendo la recolección y separación de los leucocitos de sangre periférica usado para citometría de flujo y ensayos de proliferación que permiten la caracterización de las poblaciones efectoras implicadas en el rechazo de piel y de las respuestas anti-tumorales.

Protocolo

1. Los animales

X. laevis x X. gilli híbridos LG-6 y el LG-15 clones isogénicas ¹ son de nuestra colonia de cría de la Universidad de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 y compartir LG-15 el mismo haplotipo MHC heterocigotos (a / c), pero difieren en menores de histocompatibilidad (H) loci. La progenie de estos clones son producidos por ginogénesis, en el que los huevos diploides producidos por la hembra son activados por irradiados con UV de espermatozoides (sin contribución del ADN a la progenie).

El uso de guantes es facultativa. Algunas personas prefieren no usarlos porque es más difícil de manejar a las ranas (resbaladizo) y, de hecho, parece que las ranas incómodo.

2. La purificación de gp96 de 15 / 0 del tumor (expresa tanto del tumor y menores H-Ags)

Gp96 purificación se ha descrito anteriormente ^{2, 3.} En pocas palabras, la gp96, se purifica mediante el fraccionamiento de amonio 50-70% de sulfato, seguido por ConA-sefarosa y cromatografía de DEAE. Acerca de 20-50 g de proteína se puede obtener por 1 ml de tejido tumoral. Pureza de la preparación está determinado por SDS-PAGE y tinción de plata.

3. Estimulación y la cosecha de leucocitos peritoneales (LP) de menor H-Ag-dispares LG-6 ranas

1. Crecer un 25 mL noche a la mañana E. Coli cultura en un tubo cónico de 50 ml a 37 ° C con agitación.
2. El día siguiente el calor mata las bacterias hirviéndola durante 1 hora.
3. Centrifugar el calor mató a E. Coli durante 15 minutos a 2.000 rpm (1.500 g) a 4 ° C.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en 1 / ¹⁰ de volumen de cultivo original (2,5 ml) en APBS. En este punto, el cultivo bacteriano está listo para su uso y debe ser utilizado dentro de las 24 hrs.
5. Se inyecta por vía intraperitoneal (ip) 200 (para una rana 2 pulgadas) o 300 L (para una rana de 3 pulgadas) de calor mató a la preparación de bacterias por la rana con un calibre de 25 5 / 8 de aguja.
6. Tres días después de la inyección PLs son cosechadas por lavado intraperitoneal.
7. Antes de la cosecha PL, ranas adultas son anestesiados por inmersión en una solución acuosa al 0,1% de metano sulfonato tricaína (TMS, MS-222) tamponado con bicarbonato de sodio para un máximo de 5 minutos hasta que todo movimiento cesa (duración depende del tamaño y edad). Los animales despiertan a los 10-20 minutos después del tratamiento.
8. Desinfectar el abdomen de la rana con una pequeña cantidad de etanol al 70%.
9. Inyectar 5 ml (una rana 2 pulgadas) o 10 ml (una rana de 3 pulgadas) de APBS estéril pre-calentado a temperatura ambiente en la cavidad peritoneal con un calibre de 18 1 ½ de la aguja. Retire la aguja y masajee suavemente la rana por un minuto para asegurar que el buffer se equilibra con la inyección de líquido en la cavidad del cuerpo.
10. Use un nuevo calibre 18 de 1 ½ aguja sin una jeringa para recoger el líquido peritoneal que el goteo de la parte posterior de la aguja en un recipiente limpio Tubo de 50 ml cónicos. Asegúrese de obtener la mayor cantidad de volumen inicial inyectada como sea posible. Tenga cuidado de evitar los vasos sanguíneos en la zona central de la región abdominal.
11. Una vez que se cosechan PLs poner la rana en un recipiente con agua poco profunda hasta que esté despierto y en ese momento se puede colocar de nuevo en su jaula.

4. Transferencia de pulso y Adoptivos de Lg-6 Dentro de Pls Naive Lg-6 destinatarios

1. Lavar una vez con los LP APBS frío y centrifugar a 1.000 rpm en (750 g) durante 10 min a 4 ° C.
2. Eliminar el sobrenadante y resuspender el PLs en APBS.
3. Pulso de los LP con gp96 en una concentración de 1 mg por gp96 5 x 10 ⁵ LP.
4. Una vez que la cantidad apropiada de gp96 se añade a los LP, mezclarlas pipeta e incubar en hielo durante 1 hora.
5. Centrifugar las células ya sea a 1.000 rpm durante 10 min a 4 ° C o menos 14.000 rpm durante 1 minuto para eliminar cualquier consolidados gp96.
6. Lavar los LP 3X con APBS frío para asegurar que no hay residual gp96 izquierda.
7. Resuspender las PLs pulsado a una concentración de 5 x 10 ⁵ PLs por cada 300 mL.
8. Transferencia adoptiva PLs por inyección ip utilizando calibre 25 8.5 aguja. Inyectar 300 L de PLs pulsada (5 x 10 ⁵ células) por animal.
9. Las ranas deben ser preparados por lo menos 3 días antes de continuar con injerto de piel o de los experimentos tumor desafío.

5. Ensayo de la piel del injerto

El rechazo de injertos de piel es un ensayo bien establecido en Xenopus ^{4, 5, 6.} En Xenopus, un receptor rechaza la piel de los donantes mostrando 1 o 2 desajustes haplotipo MHC dentro de 18-22 días a 21-22 ° C. Por el contrario, los injertos de piel entre LG y LG-6-15 clones que sólo se diferencian por un menor H-Ags son rechazados más lentamente (más de 30 días). Sin embargo, este rechazo se acelera en los receptores de That han sido preparados en contra de los donantes menores H-Ags, ya sea por un injerto de piel anterior o mediante la inmunización con gp96 purificada a partir de los donantes. El no rechazo en todas se produce cuando el donante y el receptor son genéticamente idénticos (por ejemplo, los animales clonados o totalmente puras). Por lo tanto, esta sencilla técnica es muy poderosa para la caracterización in vivo la respuesta inmune provocada por gp96.

1. Anestesiar a la rana de los donantes como se describe en 3.7.
   Nota: Sólo un mínimo de precauciones deben ser tomadas desde Xenopus producen potentes péptidos antimicrobianos (por ejemplo, Magainin) en la piel que evita la necesidad de total de los procedimientos asépticos. De hecho, el tratamiento de la rana con cualquier desinfectante sería perjudicial para la piel. Además, Xenopus no tienen los agentes patógenos que pueden ser transferidas a los seres humanos. Por lo tanto, el uso de guantes es opcional. Sin embargo, todos los instrumentos de disección utilizados tienen que ser esterilizados en autoclave y todas las soluciones deben ser estériles.
2. Cortar y retirar un pequeño (20 mm x 5 mm) el pedazo de piel ventral (la piel del abdomen que parece de plata debido a la presencia de irridophore células pigmentadas) que de una rana donantes LG-15 con unas tijeras.
3. Lugar de la piel en un APBS Petridish contener y mantener en hielo. Manipular el tejido de la piel con mucha suavidad, evitar la celebración que en medio de unas pinzas.
4. Utilizando una navaja o tijeras cortan injertos individuales en 5 mm x 5 mm piezas. Mantener los fragmentos en APBS en el hielo.
5. En este punto, la rana de los donantes se coloca en un recipiente con agua poco profunda hasta que esté despierto y luego se coloca en agua que contiene antibióticos (Penstrep a una concentración de 5 mg / L). La rana se mantiene en el agua con antibióticos durante dos días, momento en el que se devuelve en el agua normal. La pequeña herida en el lugar de donde se extirpó la piel no tiene que ser cosida y se cura en una semana.
6. Anestesiar el receptor LG-6 rana.
7. Haga una pequeña incisión en el dorso (parte posterior) de la piel del receptor e insertar los 5 mm x 5 mm por debajo del injerto de piel con el lado plateado hacia arriba. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire bajo la piel, ya que puede provocar el desplazamiento o incluso la pérdida del injerto.
8. Asegúrese de tomar nota de las marcas de tijeras y pinzas en los injertos, ya los que no se cuentan como el rechazo del injerto una vez que el marcador se inicia.
9. 24 horas más tarde una parte de la piel de acogida superposición debe ser eliminado del injerto.
10. Anestesiar el receptor LG-6 rana. Manejar los animales como se describe en 5.1.
11. Con la tijera autoclave cortar una ventana alrededor del injerto para que el injerto se puede visualizar libremente. Tenga cuidado de no tocar la piel de los donantes o para inducir el sangrado. Vamos a recuperar la rana como se describe en 5.5.
12. Inicio anotar el injerto de inmediato mediante la adopción de un esquema. El rechazo de injertos de piel está determinado por el porcentaje de destrucción de la irridophores en la piel injertada.
13. Los injertos deben ser controlados cada 2-3 días, pero los animales no deben ser anestesiados para esto. Para visualizar los injertos, las ranas necesitan ser colocados en un petridish bajo un microscopio de disección.

6. Todo el montaje inmunohistología de piel trasplantada

Rana de todo el montaje inmunohistología se ha descrito previamente ^6. En pocas palabras, la rana se anestesia y se coloca bajo el microscopio sobre una toalla de papel estéril pre-mojado con agua rana (el área de trabajo también es preparado asépticamente). La piel trasplantada es entonces recolectado con una pequeña cantidad de la piel circundante de acogida y se tiñeron con anticuerpos de manera similar a la tinción de células para el análisis de citometría de flujo ^6. Instrumentos en autoclave y tampones estériles deben ser usados. Después de la tinción de la piel se coloca sobre un portaobjetos de microscopio y se presiona suavemente con una hoja de cubierta. En este punto, la piel se pueden visualizar mediante un microscopio de fluorescencia para diferentes poblaciones de células que se han infiltrado en el injerto. Después del procedimiento, la rana se mantiene en el agua con antibióticos como se describe en la sección 5.5. y regresó en el agua normal. La pequeña herida a la izquierda donde la piel fue removido cura en una semana.

7. Caracterización de los leucocitos de la sangre

1. Antes de extraer la sangre de la rana, hay que preparar "agujas de cristal" tirando de pipetas Pasteur estériles sobre la llama. El extremo fino de la pipeta se agudiza bajo el microscopio estereoscópico. La pipeta se conecta a un tubo de plástico por aspiración.
   Todos los instrumentos como las pinzas y tijeras deben ser esterilizados en autoclave antes de su uso.
2. También preparan el hielo frío 10 ml de solución de heparina APBS y añadiendo 50 unidades de heparina por 1 mL de APBS. Mantener la solución en hielo. Todas las soluciones que se utilizan deben ser estériles.
3. Anestesiar a la rana como se describe en 3.7, y seguir los procedimientos de manejo de los animales mismos como se describe en 5.1. .
4. Cortar la piel por encima del pie posterior para exponerla vena dorsal del tarso.
5. Llenar la pipeta Pasteur con 2.1 mL de solución APBS + heparina.
6. Inserte la "aguja de vidrio" en la vena y se empezará a recoger la sangre lentamente, aspirando con la boca. Es importante tener solución APBS + heparina en la "aguja de cristal", ya que esto evitará que la coagulación de la sangre y la obstrucción de la punta de la aguja.
7. 1 a 2 ml de sangre se puede obtener de una rana de tamaño medio.
8. La pequeña incisión en la pierna de la rana no tiene que ser cosida y la herida se cura en una semana.
9. Se centrifuga la sangre a 1.000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
10. Eliminar el sobrenadante y lavar las células 1X con 10 ml de APBS frío.
11. Poner 2 ml de sangre (1-5 x 10 ⁶ células) en 1 ml de Ficoll Histopaque 1.077 (Sigma) previamente calentada a temperatura ambiente con el fin de separar los leucocitos de la sangre de las células rojas de la sangre.
12. Centrifugar 20 minutos a 1.000 rpm a temperatura ambiente sin frenos, y luego recoger la banda de leucocitos.
13. Lavar las células 2 veces con APBS por centrifugación a 1.400 rpm durante 10 min a 4 ° C para eliminar el Ficoll residual.
14. En este punto, las células están listas para ser teñidas con anticuerpos para el análisis de citometría de flujo, o que se utilizan en los ensayos de cultivo in vitro.

8. Ensayo de Tumor Trasplante

1. Aproximadamente una semana antes del deshielo experimentar un nuevo lote de células 15 / 0 del tumor y asegurarse de que las células empiezan a crecer bien. Medio de cultivo se describe sucintamente en el siguiente apartado y en más detalle en el ^3.
2. Expandir las células 15 / 0 del tumor.
3. En el día del experimento, el recuento de las células y determinar la muerte celular por exclusión del azul tripano. La muerte celular debe ser inferior al 5%. Lavar las células 1X en APBS frío y centrifugar a 1000 rpm a 4 ° C durante 10 min.
4. Resuspender las células en medio de cultivo del tumor, con una densidad de 5 x 10 ⁵ / 15 0 300 células por mL.
5. Trasplante de 5 x 10 ⁵ células en 300 l de volumen por la rana mediante una inyección subcutánea con un calibre de 25 5 / 8 en la aguja de un lado de la dorsal (espalda) de la animal.
6. El crecimiento del tumor se iniciará a las 2-3 semanas después de la exposición del tumor. La aparición del tumor inicial debe tenerse en cuenta el volumen del tumor y debe ser registrada cada 2-3 días. El volumen del tumor (alto x largo x ancho) se mide con un calibrador.
7. Una vez que el tumor crece hasta 3.500 mm ³ o la rana comienza a buscar letárgico, tiene que ser sacrificados para evitar el malestar.

9. Los reactivos necesarios:

• Anfibios Tampón fosfato salino (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L de Na ₂ HPO _4, 0,2 g / L KH ₂ PO. el pH a 7,5 con NaOH 10N y esterilizar por filtración a través de filtro de 0,2 micras.
• Tricaína metano sulfonato (TMS, MS-222) (Media Luna Roja de Investigación Química CAS # 886-86-2).
• Bicarbonato de sodio (Fisher Scientific-S 233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL)
• Heparina sal sódica (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Medio de cultivo para Xenopus 15 / tumores 0 [véase el punto 3 para más detalles]: 1 litro de Iscove medio DMEM basal (Gibco-Invitrogen 11965) con la insulina de 10 ml, 10 ml no aminoácidos esenciales, 10 ml de penicilina-estreptomicina, 10 mg / ml de kanamicina, 3 ml de primatone (Sheffield División de Productos), 1 ml de β2-mercaptoetanol, y 3,02 g _de NaHCO3 en agua (pH 7,0). Este medio se diluye a la osmolaridad de anfibios mediante la adición de un 30% de agua bidestilada, y se complementa con suero fetal bovino al 5%, 20% superantant de un A6 riñón Xenopus línea celular, y el 0,25% de suero normal de Xenopus.

10. Resultados representante

Figura 1. Análisis estereoscópico de rechazo del injerto de piel 12 días después del trasplante. LG-6 clonado ranas recibieron un injerto de piel por parte de (A) un MHC-idénticos LG-6 (no muestra rechazo) o (B) de un donante outbred MHC-dispares (80% de rechazo). Las flechas plateadas muestra células pigmentadas iridophore marca sanos (no rechazo) injertado tejidos. (*) Marca de fórceps no debido al rechazo.

Figura 2. Gp96, facilita la presentación cruzada de antígenos tumorales en Xenopus. LG-15 PLs (5 x 10 ⁵⁾ fueron pulsadas durante 1 hora en hielo, ya sea con APBS (control negativo), 1 mg de gp96 recombinante purificada a partir de una E. G cultura coli, o 1 ó 0,5 de la gp96 purificada a partir de 15 / 0 tejido tumoral. Después de tres lavados, las células fueron transferidas adoptiva en receptores adultos LG-15 (1 x 10 ⁶ / individual). Tres días más tarde, en vivo 15 / 0 células tumorales (5 x 10 ⁵⁾ setrasplantadas mediante inyección subcutánea. Cada curva representa la cinética del crecimiento tumoral en una rana. Reto días después, cuando los tumores aparecieron por primera vez fueron controlados, y el tamaño del tumor se determina periódicamente con un (largo x ancho x grosor) de la pinza.

Discusión

El anfibio Xenopus es una singular versatilidad de animales no mamíferos modelo para estudiar la inmunidad. Su amplio uso en la investigación biomédica e inmunológica ha dado en diversas herramientas de investigación importantes, como los clones MHC define LG LG-6 y 15, así como diferentes líneas celulares y de anticuerpos monoclonales. El uso de estas herramientas se han establecido diferentes in vitro y en ensayos in vivo para estudiar la capacidad de las proteínas de choque térmico...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos necesarios:
Solución salina amortiguada con fosfato para anfibios (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
NaOH 10 N
Tricaina metanosulfonato (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Sal sódica de heparina	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Medio de cultivo para tumores Xenopus 15/0 [véase 3 para más detalles]:
Medio basal Iscove DMEM	GIBCO, de Life Technologies	11965
Insulina
Aminoácidos no esenciales
Penicilina-estreptomicina
Kanamicina
Primatone	División de Productos Sheffield
β2-mercaptoetanol–etanol
NaHCO3
30% agua doblemente destilada
5% suero bovino fetal
20% del sobrenadante de una línea celular de riñón de Xenopus A6
0,25% de suero normal de Xenopus
Materiales y equipos:
Tubos cónicos estériles para centrífuga de 50 y 15 ml
Agujas estériles Precision Glide de 25 gauge, 5/8	BD Biosciences
18 gauge 1½ Agujas estériles Precision Glide	BD Biosciences
Jeringa estéril de 1 ml con punta deslizante para tuberculina	BD Biosciences
Jeringa estéril de 10 ml con punta de deslizamiento	BD Biosciences
Tubos microcentrífugos de 1,5 ml (estériles)
Placas de Petri de poliestireno estériles de 60 x 15 mm	Falcon BD
Cuchillas de afeitar
Láminas de microscopio premium de 25 x 75 mm x 1 mm	Fisher Scientific
placas de Petri de vidrio de 10 cm
9" Pipetas Pasteur de vidrio borosilicato Durex desechables con tapón de algodón	VWR international
Tubo Tygon
Dos # 5 de joyero suizo’s Pinzas	Miltex Inc.
Tijeras de disección microquirúrgicas McPherson-Vannas con filo recto de 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
Calibradores Helios
Microscopio de disección
Iluminador de alta intensidad
Hemocitómetro
Desconectar el mechero Bunsen
37°incubadora con agitación
Centrifugar