ADN de isótopos estables de sondeo es un método de cultivo independiente para identificar y caracterizar las comunidades activas de microorganismos que son capaces de utilizar sustratos específicos. Asimilación de sustrato enriquecido en los isótopos pesados lleva a la incorporación de los átomos marcados en la biomasa microbiana. Ultracentrifugación en gradiente de densidad recupera la etiqueta de ADN para posterior análisis molecular.
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Artículo de método
ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)
En este artículo
Resumen
Resumen
ADN de isótopos estables de sondeo (ADN-SIP) es una poderosa técnica para la identificación de microorganismos activos que asimilar ciertos sustratos de carbono y nutrientes en la biomasa celular. Como tal, esta técnica de cultivo-independiente ha sido una importante metodología para la asignación de la función metabólica de las diversas comunidades que habitan en una amplia gama de ambientes terrestres y acuáticos. Después de la incubación de una muestra ambiental con isótopos estables compuestos marcados, el ácido nucleico extraído se somete a ultracentrifugación en gradiente de densidad y el fraccionamiento del gradiente posteriores para separar los ácidos nucleicos de diferentes densidades. La purificación del ADN a partir de cloruro de cesio recupera no marcado y marcado de ADN para posterior caracterización molecular (por ejemplo, huellas dactilares, microarrays, bibliotecas clon, la metagenómica). Este protocolo de vídeo JoVe proporciona visuales paso a paso las explicaciones del protocolo de gradiente de densidad gradiente de fraccionamiento de ultracentrifugación, y la recuperación de ADN marcado. El protocolo también incluye la muestra de datos SIP y pone de relieve importantes consejos y precauciones que se deben considerar para asegurar el éxito de ADN-SIP análisis.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos
ADN-SIP requiere el uso de reactivos que se deben preparar con antelación del procedimiento actual. Las instrucciones para la preparación de cada reactivo se muestran en esta sección y se modifican a partir de una anterior protocolo SIP 1.
- Cloruro de cesio (CsCl) solución para la preparación de los gradientes de SIP - Preparar una solución 7.163 M CsCl gradualmente disolviendo 603,0 g de CsCl en agua destilada y desionizada (DDC 2 O) a un volumen final de 500 ml. Tenga cuidado de no exceder de 500 ml! El calentamiento de la solución mientras se agita ligeramente ayudará a di....
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Discusión
El diseño apropiado de isótopos estables experimentos de sondeo es de importancia crítica para la obtención de ADN marcado por encima de la comunidad de fondo sin etiquetar. Consideraciones relacionadas con la muestra de los tiempos de incubación, las concentraciones de sustrato, las condiciones de incubación (por ejemplo nutrientes, contenido de humedad del suelo), cruzar la alimentación y la replicación se han discutido en otros lugares 10,18 y se recomienda al lector consultar estas publicaciones en el dis.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Estratégico de Subvenciones y descubrimiento de JDN de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Azul de bromofenol | Reactivo | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cloruro de cesio | Reactivo | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Etil alcohol, grado reactivo | Reactivo | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Bromuro de etidio | Reactivo | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Ácido clorhídrico | Reactivo | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Poliacrilamida lineal | Reactivo | Applichem | A6587 | |
| Polietilenglicol 6000 | Reactivo | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Cloruro de potasio | Reactivo | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Cloruro de sodio | Reactivo | Fisher Scientific | S2711 | |
| Gránulos de hidróxido de sodio | Reactivo | Fisher Scientific | S3181 | |
| Base de Tris | Reactivo | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Lector oscuro | Equipo | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrífuga | Equipo | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipo | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Bomba de infusión | Equipo | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Número de modelo: BSP Consulte www.braintreesci.com para detalles de pedido. |
| Sellador de tubos | Equipo | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrífuga | Equipo | Beckman Coulter Inc. | ||
| Rotor de ultracentrífuga | Equipo | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Fuente de luz ultravioleta | Equipo | UVP Inc. | 95-0017-09 | Cualquier fuente UV es adecuada |
| Protector facial para luz ultravioleta | Equipo | Fisher Scientific | 114051C | |
| Taponcillos de caucho butílico, grises | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Tubos para centrífuga | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Aguja hipodérmica, calibre 23, longitud de 2” | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Tubos para microcentrífuga, 1,5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Sellos centrales abiertos, diámetro de 20 mm | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pipetas de Pasteur, de vidrio | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Puntas de pipeta | Material | DiaMed | BPS340-1000 | El número de catálogo corresponde a puntas de 200 μl. Pueden adquirirse puntas de 10 o 20 μl del mismo proveedor |
| Tubo de bomba, diámetro interno de 1,5 mm x pared de 1,5 mm | Material | Appleton Woods | ||
| Tubos con tapón roscado, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Viales de suero, volumen de 125 mL | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Jeringa, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
Referencias
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a t....
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Reimpresiones y permisos
