Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

Resumen

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

Resumen

La utilidad de los enfoques de una sola molécula de microscopía de fluorescencia se ha demostrado ser de una gran disponibilidad en la comprensión de las reacciones biológicas en la última década. La investigación de las interacciones moleculares con alta resolución temporal y espacial profunda dentro de las células se ha mantenido un reto debido a las señales de por sí débil que surgen a partir de moléculas individuales. Obras recientes de Yang et al. demostrado que estrecha el campo de microscopía de epifluorescencia permite la visualización de transporte nucleocytoplasmic en el nivel de una sola molécula. Por el enfoque de una sola molécula, la cinética importantes, como el tiempo de transporte nuclear y la eficiencia, para las moléculas de carga depende de la señal e independientes se han obtenido. Aquí se describe un protocolo para el abordaje metodológico, con una mejor resolución espacio-temporal de 0,4 nm y 12 ms. La resolución mejorada que nos permitió la captura de transporte activo y eventos transitorios pasiva difusión a través de los complejos de poro nuclear (NPC) en semi-células intactas. Esperamos que este método es utilizado en el esclarecimiento de otros eventos de unión y el tráfico dentro de las células.

Protocolo

1. Preparación del sistema celular para el experimento de una sola molécula

1. Por lo menos una semana de antelación, iniciar un cultivo fresco de la línea celular HeLa de un stock de descongelación a 37 º C y poner en un frasco de cultivo de 25 cm ² con 5 ml de medio, incuban las células a 37 º C en 5% de CO ₂ incubadora durante 24 horas y se dividió al menos 3 veces a fin de ofrecer condiciones óptimas para las células. Sin embargo, las células no se debe dividir más de 20 veces debido a la tendencia de su tasa de crecimiento para disminuir de manera significativa. Células HeLa fueron previamente manipuladas genéticamente para tener GF....

Discusión

Se debe tener cuidado para asegurar un adecuado colocalización de moléculas de NE y solo durante el experimento. También es importante proporcionar una relación señal ruido, sobre todo cuando la señal es baja debido a un etiquetado deficiente o photobleaching. Precisión de localización está limitada por el ruido de fondo (que surge de la fluorescencia fuera de foco, el ruido CCD de lectura, los factores de la corriente oscura y otros).

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