Artículo de método
Pseudofracture, un modelo reproducible murino de trauma musculoesquelético estéril, permite la evaluación de finales de término post-traumático respuestas inmunes. En este artículo se describe el procedimiento de ejecución de la etapa de modelo a paso, incluyendo el potencial de las combinaciones de modelos experimentales para permitir el estudio de un politraumatismo.
Después de un trauma es una de las primeras hiper-reactiva respuesta inflamatoria que puede conducir a la disfunción de múltiples órganos y la alta mortalidad en pacientes con traumatismos, esta respuesta es a menudo acompañado por una inmunosupresión retraso que se suma a las complicaciones clínicas de la infección y también puede aumentar la mortalidad 1-9. Muchos estudios han comenzado a evaluar los cambios en la reactividad del sistema inmune después de un trauma. 10-15
Estudios inmunológicos son un gran apoyo a través de la amplia variedad de transgénicos y ratones knock-out disponible en modelos in vivo;. Cepas de estas ayudas en la investigación detallada para evaluar las vías moleculares implicadas en la respuesta inmunológica 16-21
El desafío en el modelado de experimentación murino trauma es la investigación a largo plazo, como las técnicas de fijación de la fractura en ratones, puede ser compleja y no fácilmente reproducible. 22-30
Este modelo pseudofracture, un modelo de trauma fácilmente reproducible, supera estas dificultades inmunológicamente simulando un ambiente de fractura de las extremidades, al tiempo que permite la libre circulación en los animales y la supervivencia a largo plazo sin el uso continuo y prolongado de la anestesia. La intención es recrear las características de la fractura de huesos largos; músculo lesionado y el tejido blando están expuestos a los huesos y la médula ósea dañada sin romper el hueso de origen.
El modelo pseudofracture consta de dos partes: una lesión muscular aplastamiento bilateral de las extremidades posteriores, seguida de la inyección de una solución de hueso en los músculos lesionados. La solución de los huesos es preparado por la recolección de los huesos largos de ambos miembros posteriores de su edad y peso con ajuste donantes singénicos. Estos huesos son triturados y luego volvieron a suspender en tampón fosfato salino para crear la solución de los huesos.
Fractura de fémur bilateral es un modelo de uso común y bien establecida de trauma extremo, y fue el modelo comparativo durante el desarrollo del modelo pseudofracture. Entre la variedad de modelos de fractura disponibles, se optó por utilizar un método cerrado de fracturas con lesiones de tejidos blandos como la comparación con el pseudofracture, ya que queríamos un estéril pero grave proporcionalmente modelo de trauma de los tejidos periféricos. 31
El shock hemorrágico es un hallazgo común en el marco de un trauma severo, y la hipoperfusión global agrega un elemento muy relevante para un modelo de trauma. 32-36 El modelo pseudofracture se puede combinar fácilmente con un modelo de shock hemorrágico por un modelo de trauma múltiple de alta severidad 37.
1. Instrumentos y la preparación del campo quirúrgico:
Todos los procedimientos experimentales se llevan a cabo utilizando técnicas asépticas. Antes de comenzar, el área experimental debe ser limpiado y esterilizado. La mesa de trabajo deben ser desinfectados, deja secar al aire y luego limpiar con alcohol al 70%. Coloque una almohadilla quirúrgica azul y campo estéril vendaje en el área de trabajo experimental.
Todos los materiales e instrumentos esterilizados en autoclave antes de su uso. Las jeringas y agujas estériles que se reciban. El investigador debe estar adecuadamente vestidos con bata, mascarilla quirúrgica y guantes quirúrgicos estériles.
Nuestros instrumentos quirúrgicos son esterilizados en autoclave cada noche. Ellos se lavan después de la cirugía utilizando un jabón antibacterial y agua. Ellos se dejan secar sobre un paño limpio pad azul quirúrgica. Luego se coloca cuidadosamente en una bolsa de esterilización y esterilizado para su uso posterior.
A su vez en el esterilizador de cuentas en caliente para asegurarse de que alcance la temperatura adecuada - 300-350 ° F antes de comenzar el experimento. Este esterilizador se utiliza para limpiar los instrumentos entre los procedimientos experimentales en ratones respectivos. Obtener una bandeja de acero inoxidable instrumento y llenar 1 / 3 de la forma con el 70% de etanol. Debe haber suficiente etanol al 70% para cubrir sus instrumentos quirúrgicos. A su vez sobre el cojín eléctrico que circula y colocar una almohadilla quirúrgica azul sobre él y luego un campo estéril vendaje en la parte superior de eso. Este calentador se utiliza para asegurar el calor adecuado del ratón durante el procedimiento experimental y el período de recuperación. Coloque todos los instrumentos estériles, gasas, jeringas, agujas y un tubo de microcentrífuga 1,5 ml en el vendaje campo estéril. Tenga cuidado al abrir los instrumentos estériles y otros artículos, no para contaminar al tocarlos. Lo mejor es utilizar guantes estériles cuando se hace este procedimiento de instalación.
2. Modelo Pseudofracture - Procedimientos experimentales:
1. Inducción de la anestesia y la posición del ratón.
Comience por la administración de una inyección intraperitoneal de Pentobarbitol (70mg/kg). Esto se logra, en primer lugar levantar el ratón de la jaula con el extremo proximal de la cola. El ratón deben ser sopesados para calcular la dosis correcta de anestésico. Luego, coloque el animal en la parte superior de la jaula, mientras que mantiene su cola. Coge la piel del cuello del ratón con el dedo pulgar y el dedo medio a ambos lados del ratón justo detrás de las patas delanteras. El dedo índice se utiliza para tirar de la piel en la región de la cabeza / cuello hacia atrás y parcialmente inmovilizar la cabeza. La cola del ratón se mantiene entre el dedo meñique y el anular, mientras que el dedo anular se presiona en la región lumbar de la columna vertebral del ratón. La anestesia debe tener plena vigencia en un plazo aproximado de 5 minutos, y debe ser confirmado con la prueba de reflejo.
Después de que el animal está durmiendo, ponga el cursor en la posición supina sobre una tabla de plexiglás y el uso de una técnica de lazo de la cinta suelta para inmovilizarlos con cinta adhesiva a sus extremidades. La técnica de lazo flojo simplemente implica cortar tiras de cinta de embalaje y la cinta libremente alrededor de la porción distal de cada extremidad. La cinta se pegaron a sí mismo y la izquierda sobre la cinta está conectado a la placa. Esto permite la manipulación experimental que se realiza de una manera coherente, así como garantizar las extremidades de los ratones asumir una posición más natural. Región abdominal, inguinal y muslo del animal, luego se afeitó con nuestra Oster Clippers A5 (tamaño de la hoja 40), para ayudar a mantener un campo estéril. Una gasa de 4x4 se moja con betadine y el área quirúrgica se limpió para esterilizar. Un vendaje campo estéril se dobla y se cubre todo el ratón para permitir la exposición de sólo las extremidades inferiores y la cabeza.
Después de la inmovilización y la esterilización, coloque un cono de la nariz con isoflurano sobre la nariz del ratón durante unos segundos antes de comenzar el procedimiento experimental. El cono de la nariz consiste en un tubo cónico de 50 cc llena con una gasa. La mitad de la parte inferior del tubo se corta la creación de un espacio para la nariz del ratón para encajar. Una tapa (parte inferior de un contenedor de almacenamiento de tejidos frasco de boca ancha, es decir lado derecho) se coloca en el extremo del corte de la forma cónica para asegurar que los vapores de isoflurano permanecer en el tubo cuando no esté en uso. Un ml de isoflurano, debe añadirse a la gasa dentro del cono. La atención meticulosa atención a los ratones durante el uso de la anestesia y en particular el uso de isoflurano a través del cono de la nariz. Una vez que las respiraciones de los animales comienzan a disminuir, el experimento puede comenzar, y el cono de la nariz debe ser retirado y cerrado.
Si la anestesia se requiere a través de cualquier parte del experimento, adicionales pentobarbital puede ser inyectada o administrada isoflurano. Métodos alternativos de administración de isofluorano están disponibles y las directrices actualizadas de recomponer fin al uso de un vaporizador de precisión para permitir un mejor control de la anestesia, si es posible. Sin embargo, la atención a la fisiología respiratoria del ratón deben ser garantizadas con cualquiera de estos métodos.
2. Pseudofracture experimento.
Pseudo-fractura es una combinación de lesiones de tejidos blandos seguida de la inyección ósea solución al músculo lesionado y se lleva a cabo de forma bilateral a las extremidades posteriores. La solución de hueso debe estar preparado ante cualquier manipulación experimental de los ratones receptores comienza.
3. Preparación de la solución del hueso.
La solución preparada a partir de huesos de ratón donante será suficiente para tres ratones receptores. Un ratón de donantes singénicos se debe utilizar es la edad y el peso a juego con el ratón receptor experimental.
El ratón de los donantes serán sacrificados con inhalación de isoflurano. El donante será pegado a la placa de plexiglás con especial atención a la cinta de las extremidades inferiores solo en la punta del pie. Las extremidades inferiores deben ser cuidadosamente afeitado y bien cubierto de betadine, y luego se limpió con alcohol para la esterilidad. Entonces, el fémur y la tibia se extirpa quirúrgicamente de una manera estéril de ambas extremidades inferiores. Para quitar los huesos largos de las extremidades inferiores, hacer una incisión quirúrgica en la piel en la región inguinal, y seguir para cortar la piel a lo largo de la longitud de la extremidad, hasta el tobillo. Retraer la piel y diseccionar lejos de la fascia subcutánea y el músculo, tanto en los aspectos medial y lateral para la exposición máxima. Inserte una hoja de la tijera en los músculos que se encuentran anterior y lateral de la tibia (el tibial anterior, extensor largo de los dedos, extensor largo del dedo gordo hallicus, peroneo largo, peroneo lateral corto) y deslice la hoja proximal y distal de los músculos para levantar limpiamente desde el hueso subyacente. Repita esta técnica en la parte inferior posterior y medial de la tibia para separar los músculos debajo de la tibia (gastrocnemio, el sóleo, plantar, tibial posterior, flexor largo de los dedos, flexor largo del hallicus). Un esfuerzo adicional mínimo se debe utilizar en la parte posterior cuando se desliza distalmente, con el fin de snap del peroné lejos de la tibia. En el extremo proximal de los músculos de la pierna corta los tendones tan cerca de sus inserciones como sea posible y retirar los músculos distal, mientras que tirando del grupo de músculos en conjunto de forma descendente un pequeño tirón dará a conocer los archivos adjuntos distal de los músculos de la articulación del tobillo. La articulación del tobillo se puede cortar a través directamente con las tijeras. No desconecte la tibia del fémur en este momento! Esta conexión da un impulso adicional que le ayuda en la disección del fémur de la articulación de la cadera. Seguir una técnica similar para la liberación de los músculos del fémur y llevar a cabo esta posterior y dos en sentido medial y lateral también si es necesario. Cortar la inserción distal de estos grupos de músculos para liberarlos de la articulación de la rodilla. Continuar con la disección y siga por debajo de los músculos para diseccionar el extremo del fémur fuera de la articulación de la cadera. Para ayudar en esta disección, la incisión de la piel debe ampliarse en la medida necesaria para lograr una exposición adecuada. El movimiento del fémur en la articulación de la cadera puede ayudar a localizar el extremo proximal del fémur durante la disección.
Una vez que el fémur (con adjuntos tibia) se retira del ratón donante colocarlos en una 4x4gauze estéril. Los dos huesos se pueden separar en la articulación de la rodilla, simplemente agarrando cada hueso en una mano separada y girando suavemente / rotación de los dos huesos en direcciones opuestas a lo largo de su eje longitudinal. Disección suave y el manejo de estos dos huesos se recomienda, ya que pueden ser fácilmente fracturada con algún esfuerzo más de la manipulación manual. Para eliminar la unión de los tendones que queda de los huesos largos, use un trozo de gasa estéril seca 4x4 envuelto alrededor de la longitud del hueso. Tome esta gasa firmemente contra el hueso de un tire toda la longitud del hueso varias veces, esto se raspa el resto de los tejidos de la superficie del hueso, ya que se adhiere a la gasa y ser rápida y fácilmente se alejó de los huesos. Los huesos procedentes de entonces se debe colocar directamente en un tubo de microcentrífuga estéril y 1,5 ml en hielo para su transporte.
Estos cuatro huesos de los donantes será llevado a una cabina de seguridad biológica para la preparación de la solución de los huesos. La campana debe ser cuidadosamente desinfectado antes de usarlo, se coloca un campo estéril vendaje sobre el área de trabajo dentro de la campana. Coloque un mortero estéril y mano, tubo de 8 ml estéril y estéril tamponada con fosfato salino (PBS) en el área de trabajo. A 1 ml pipetteman y consejos respectivos deberán estar disponibles dentro de la campana.
Un par de pinzas estériles se debe utilizar para extraer los huesos cosechados de forma estéril del tubo de microcentrífuga 1,5 ml y se coloca en el mortero, la mano del mortero será utilizado para aplastar suavemente los huesos. PhosphSaline comió buffer es el vehículo utilizado para volver a suspender los fragmentos de hueso para la inyección. Pipeta de 1 ml de PBS en el mortero y continuar para aplastar a los fragmentos restantes, con movimientos circulares adicionales para asegurar la resuspensión completa. A continuación, añadir otro 1 ml de PBS y seguir aplastando a la creación de la "solución de hueso". La solución debe tener una tonalidad rosada, y no habrá restos de la izquierda en la parte inferior del mortero que no puede ser completamente roto. Verter lentamente la solución del mortero en el tubo de 8 ml, para coger el máximo de volumen, garantizando al mismo tiempo los restos más grandes se quedan en el mortero. Esta solución hueso debe permanecer en hielo hasta su uso experimental y será transferido a las jeringas de 1 ml para inyección. Una aguja de calibre veinte será más adelante unido a la jeringa de 1 ml con la solución de los huesos con el fin de administrar el ratón. Este tamaño de la aguja grande fue elegido para asegurar que todos los fragmentos de hueso entrar en la región después de la inyección y no bloquear la aguja.
Antes de la inyección de ratón receptor, una gota de la solución del hueso se coloca sobre una placa de agar MacConkey para la cultura (de incubación de 24 48 horas). Esto es para garantizar la esterilidad de la solución de los huesos. El pH de la solución de los huesos también deben ser revisados para asegurar un pH neutro.
4. Lesiones de tejidos blandos.
Esta lesión de tejidos blandos es una lesión en la extremidad posterior aplastamiento bilateral. El posicionamiento inicial del ratón, con las patas traseras ligeramente abducido y rotado lateralmente, ayuda en la accesibilidad al grupo correcto de músculos, los flexores de la rodilla (bíceps femoral, semitendinoso y semimembranoso músculos). Una pinza hemostática 18cm grandes serán utilizados para llevar a cabo la lesión por aplastamiento. La distribución de la fuerza de estos hemostatos aplicada fue analizada y se comprobó que 270psi utilizando el Sistema de Análisis de la presión por Topaq Sensor Products Inc. La hemostasia debe ser fijada alrededor de la musculatura del muslo posterior, el punto medio a lo largo del fémur, con su curva convexa hacia el fémur. La hemostasia debe entonces ser bloqueado cierre a la primera posición única, y se mantienen durante 30 segundos. La atención cuidadosa a la colocación de esta pinza hemostática es importante - no debe ser fijada sobre el fémur, para asegurarse de que no hay fractura. Esto debería ser realizado de una manera consistente cada vez que para garantizar una lesión reproducible entre los ratones. Esta lesión por aplastamiento se lleva a cabo en ambas extremidades inferiores.
5. Hueso inyección de la solución.
El ratón receptor experimental será anestesiado y preparado como se describió anteriormente, y que han sufrido lesiones de tejidos blandos antes de la inyección de hueso.
La solución hueso entonces se inyecta en la musculatura del muslo aplastado del ratón receptor bilateral. Utilizando una aguja de calibre 20, 0.15mL de esta solución se inyecta en los músculos posteriores de los muslos. Introduzca la aguja a través de la piel alrededor de 2 ~ 3 mm y prestar atención a la distancia de la inserción de la aguja - se siente como la punta del bisel que toque contra el fémur, esta posición es ideal. Se inyecta la solución hueso ahora. Retire la aguja y poner rápidamente un dedo enguantado estéril sobre el sitio de la inyección para detener cualquier flujo de retorno de la solución de los huesos de la herida. Mantenga este dedo que durante varios segundos.
El ratón y luego se vuelve a colocar en la jaula y se deja plena libertad de circulación directamente como desaparece la anestesia. Manejo apropiado del dolor se debe administrar en el ratón despierta.
6. Post-operative/recovery período.
La cinta de lazo flojo se retira y los animales son colocados en una jaula limpia que se mantiene en una almohadilla eléctrica que circula por la recuperación de varias horas después. Calor adecuada debe garantizarse con una lámpara de calor adicionales si es necesario.
Alimentos y el agua esté fácilmente disponible.
Analgésico se debe administrar en los animales comienzan a despertar de la anestesia con el fin de gestionar correctamente el dolor. La buprenorfina (0.1mg/kg) se inyecta por vía subcutánea que los animales comienzan la actividad física, pero no antes, para no comprometer la función respiratoria.
Los ratones deben ser constantemente monitoreados durante la anestesia, hasta que la recuperación de la anestesia o de punto final experimental. Los ratones se debe también ser muy cuidadosamente en el período postoperatorio y los medicamentos para el dolor adicional debe ser administrada cuando sea necesario. Monitorear la actividad física de los animales, el estado respiratorio, la alimentación y la ingesta de agua y cualquier señal de peligro (dificultad para respirar, dolor, cambios en los hábitos de comer y beber) debe ser abordado en consecuencia.
Coloque el instrumental quirúrgico en 70% de alcohol y limpie con una gasa estéril y luego ponerlos en el esterilizador microesferas de 20 segundos para la esterilización entre los animales. Saque los instrumentos quirúrgicos y rociarlos con alcohol al 70% para ayudar a enfriar. Colocarlos en el sterile faenado. Asegúrese de que no hay alcohol a la izquierda en los instrumentos que goteará a volver a los animales al lado.
3. Comparativo del fémur bilateral modelo de fractura - Procedimientos experimentales:
El ratón experimental será anestesiado y preparado como se había descrito. Una pinza hemostática 18cm grandes deben sujetarse alrededor de la extremidad posterior de aproximadamente 2 a 3 mm por encima de la articulación de la rodilla con su superficie convexa hacia la rodilla. Coloque el pulgar en la parte superior de la pinza hemostática pinza y el dedo índice entre la pinza y la cadera. Asegúrese de sentir el fémur antes de girar para que sepa donde están rompiendo. A continuación, gire hacia la izquierda hemostato mientras gira la otra mano hacia la derecha.
Repita el procedimiento con la pierna contralateral.
4. Modelo de trauma múltiple - procedimiento experimental para la combinación de Pseudofracture con shock hemorrágico:
Ratón receptor será anestesiado y preparado como se había descrito. Los ratones que se someterán a un shock hemorrágico en combinación con la pseudo-fractura tendrá canulación de la arteria femoral antes del procedimiento pseudofracture y luego será una hemorragia de este catéter una vez que la fractura pseudo-se ha completado.
5. Secretos para el éxito:
General:
Hueso preparación de la solución:
Lesiones de tejidos blandos:
Hueso inyección de la solución:
6. Nota preocupaciones operativo:
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Pseudofracture, un modelo reproducible murino de trauma musculoesquelético estéril, permite la evaluación de post-traumático respuestas inmunes. El modelo pseudofracture inmunológicamente simulando un entorno de fractura de la extremidad a través de la recreación de las características de una fractura de hueso largo: músculo lesionado y el tejido blando están expuestos a los huesos y la médula ósea dañada sin romper el hueso nativo 38,39 una respuesta inmunitaria bifásica se puede ver a continuación. trauma p...
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Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo y la conducta de Investigación y Cumplimiento de la Universidad de Pittsburgh, una institución AALAS / AAALAC acreditados. Las fuentes animales incluyen Jackson Laboratories y Laboratorios Charles Rivers. Todos los animales se someten garantía de salud amplia a través de cada proveedor, así como la Universidad de Pittsburgh programas internos de vigilancia de la salud de los animales. Esta investigación se lleva a cabo de acuerdo con los directores de gobierno de los EE.UU. para el uso de animales vertebrados. El programa está registrado con el USDA, y tiene una carta de garantía con la Oficina de Servicios de Salud Pública de Protección de los Animales de Laboratorio.
Fuente de Financiamiento / Número de Biología Molecular del shock hemorrágico GM053789
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Almohadilla quirúrgica azul | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Apósitos de campo estériles | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Almohadilla térmica circulante 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Esterilizador de instrumentos de perlas calientes | VWR international | 11156-002 | |
| Bandeja de acero inoxidable 8" x 11" | VWR internacional | 62687-049 | |
| Tableros de plexiglás (10x15x0,5cm) | Taller | ||
| Rollos de cinta 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| Tubo cónico de 50cc | Cualquier Proveedor | ||
| Frascos de boca ancha de lado recto (utilizados como tapa para el cono de la nariz) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 Maquinillas con tamaño 40 hoja | VWR international | 10749-020 | |
| Tijeras quirúrgicas (rectas – 12cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Hemostáticos curvos -18cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Pinzas (0,8 mm de punta, curvadas de 10 cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gasa 4"x4" | Cualquier proveedor | ||
| Tubo de microfuga de 1,5 cc | Cualquier proveedor | ||
| Cubo de hielo | Cualquier proveedor | ||
| Mortero y maja | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| Jeringa de 1 cc con aguja de 25 G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Aguja de 20 G | Cualquier proveedor | ||
| Pipeteman de 1 ml | Cualquier proveedor | ||
| Puntas de pipeta de 1 ml | Cualquier proveedor Tubos | ||
| de poliestireno halcón de 8 ml | VWR international | 60819-331 | |
| Bolsa de esterilización 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Bolsa de esterilización 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Placa de agar | BD Biosciences | 221172 | |
| Alcohol etílico - 200 grados | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital Sódico (Nembutol Solución Sódica) | OVATION Pharmaceuticals | 70mg/kg | |
| Aerrane (Isoflurano) | Baxter Internationl Inc. | 99,9% | |
| Triadina, Povidona Yodada (Betadine) | Triad desechables | ||
| , Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | |||
| Bedford Laboratories | 0,1 mg/kg |
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