Toxoplasma gondii se convierte en una forma de quiste en respuesta al estrés ambiental, que puede ser imitado en los modelos de cultivo de tejidos. Este video muestra las técnicas para examinar la formación de la pared del quiste mediante la activación de médula ósea procedentes de los macrófagos o el cambio de pH de crecimiento medio en las células de fibroblastos.
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Artículo de método
Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto
En este artículo
Resumen
Resumen
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que puede invadir cualquier célula nucleada de animales de sangre caliente. Durante la infección, T. gondii difunde como una forma de replicar rápida llamada de taquizoitos. Taquizoitos de convertirse en una forma enquistada de crecimiento lento llamado bradizoíto por un proceso de señalización que no está bien caracterizado. Dentro de los animales, los quistes bradizoíto se encuentran en el sistema nervioso central y el tejido muscular y representan la etapa crónica de la infección. La conversión a bradizoítos se pueden simular en el cultivo de tejidos de CO 2 de hambre, utilizando un medio con un pH alto, o la adición de interferón gamma (IFN). Bradizoítos se caracterizan por la presencia de una pared del quiste, a la que la lectina de Dolichos biflorus aglutinina (DBA) se une. DBA etiqueta fluorescente se utiliza para visualizar la pared del quiste en los parásitos cultivados en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) que han sido expuestos a bajas emisiones de CO 2 y medio de alto pH. Del mismo modo, los parásitos que residen en el hueso murinas derivadas de la médula macrófagos (BMMs) muestran una pared del quiste detectable por DBA después de la BMMs se activan con IFN y lipopolisacárido (LPS). Este protocolo será demostrar cómo inducir a la conversión de T. gondii a bradizoítos utilizando un medio de pH alto crecimiento con bajas emisiones de CO 2 y la activación de BMMs. Las células huésped se cultivaron en cubreobjetos, infectados con taquizoítos y sea activado con la adición de IFN y LPS (BMMs) o expuestos a un medio de pH alto crecimiento (HFFS) de tres días. Al término de las infecciones, las células huésped se fija, permeabilized y bloqueado. Las paredes del quiste se visualizan mediante DBA rodamina con microscopía de fluorescencia.
Protocolo
1. Preparación de fibroblastos de prepucio humano (HFF) recubierto cubreobjetos
- Coloque un cubreobjetos de vidrio estériles redonda sobre el fondo de los pozos de una placa de tejido de 24 pocillos.
- Para la cosecha de un HFFS confluentes 150 cm 2 matraz, enjuagar el frasco dos veces con PBS 1X y añadir 2,5 ml de 0,025% de tripsina-EDTA. Incubar matraz a 37 ° C durante 5-10 minutos.
- Tocando el lateral del recipiente contra la palma de su mano puede ayudar a separar las células del frasco. Una vez que las células se han dado de alta del matraz, añadir 150 ml de HFF medio (Dulbecco modificada de Eagle Medium [DMEM] con 10% de SF....
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Discusión
Si bien el mecanismo de desarrollo bradizoíto no se entiende completamente, los análisis de genética molecular de T. conversión gondii etapa de cultivo de tejidos ha llevado al descubrimiento de genes que están involucrados en la formación de quistes bradizoíto 2,3,4. El análisis también dio lugar a la observación de que algunos marcadores bradizoíto se expresan en otras condiciones de estrés prolongado, como el crecimiento en los macrófagos activados 5,6. Los métodos anteriores d.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro distinguida Graduate Fellowship (CMT), premio NIH AI072817 (AMP) y la Asociación Americana del Corazón Premio 0840059N (LJK).....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’Medio de Eagle modificado (DMEM) | GIBCO, por Life Technologies | 11960-051 | |
| Suero bovino fetal (SBF) | Atlanta Biologicals | S11150 | inactivar por calor |
| Rodamina Dolichos biflorus aglutinina | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehído (16 %) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glicina | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Almacenar en alícuotas de un solo uso |
| L-glutamina (200 mM) | GIBCO, por Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolisacárido (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Almacenar en alícuotas de un solo uso |
| Cubreobjetos para microscopio | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO, por Life Technologies | 15140 | |
| Polvo de medio RPMI 1640 (con L-glutamina, sin bicarbonato) | GIBCO, por Life Technologies | 31800-022 | |
| Tritón X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tripsina-EDTA (0,25 %) | GIBCO, por Life Technologies | 25200 | |
| Medio de montaje VectaShield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referencias
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S.
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Reimpresiones y permisos
