Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en una nueva estrategia se ha desarrollado, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana. Aquí, tkRNAi se aplicó con éxito para la reversión de la resistencia a múltiples fármacos clásicos ABCB1 mediada (MDR) de las células cancerosas.
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Artículo de método
Entrega bacteriana de RNAi efectores: Transkingdom RNAi
En este artículo
Resumen
Resumen
ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo altamente efectivo para la inhibición específica de la expresión del ARNm. Además de su potencial como herramienta de laboratorio poderosa, la vía de RNAi parece ser prometedora para la utilización terapéutica. Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en la entrega de RNAi agentes mediadores de las células diana es uno de los principales obstáculos. Una nueva estrategia para superar este obstáculo es transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas, por ejemplo, Escherichia coli, para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana para inducir RNAi. Una primera generación de los conocimientos tradicionales RNAi mediar vector, viaje, contiene el promotor del bacteriófago T7 para la regulación de la expresión de un ARNhc terapéuticas de interés. Además, el lugar ha VIAJE Inv de Yersinia pseudotuberculosis que codifica invasina, lo que permite bacterias naturales no invasivas para entrar β1-integrina-positivo células de mamíferos y el gen HlyA de Listeria monocytogenes, que produce listeriolisina O. Esta enzima permite la shRNA terapéutica para escapar de la entrada de vesículas en el citoplasma de la célula diana. Construye TRIP se introducen en un tribunal competente no patógena cepa de Escherichia coli, que codifica la ARN polimerasa T7 necesarios para la T7 promotor impulsado por la síntesis de shRNAs. A bien caracterizados asociados con el cáncer molécula diana de las diferentes estrategias de RNAi es ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador actúa como una bomba de extrusión de drogas y media la "clásica" ABCB1 mediada por la resistencia a múltiples fármacos (MDR) fenotipo de las células de cáncer humano que se caracteriza por un patrón de resistencia cruzada específica. ABCB1 diferentes que expresan las células cancerosas MDR fueron tratados con anti-ABCB1 del shRNA vector de expresión E. rodamientos coli. Este procedimiento dio lugar a la activación de las vías de ARNi en las células cancerosas y una regulación considerable abajo del ARNm que codifica ABCB1, así como la bomba de extrusión de drogas correspondiente. En consecuencia, la acumulación del fármaco fue mayor en las células cancerosas resistentes a los medicamentos prístina y el fenotipo MDR fue revocada. Por medio de este modelo los datos que presente la prueba de concepto que los conocimientos tradicionales RNAi es adecuado para la modulación de los factores asociados con el cáncer, por ejemplo, ABCB1, en células de cáncer humano.
Protocolo
1) Entrega bacteriana de shRNAs
- Antes de comenzar con el cultivo bacteriano, uno tiene que preparar LB-medio y LB-agar.
- Para el LB-medio pesar de extracto de levadura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) y NaCl (0,6% w / v) y diluir estos componentes en agua bidestilada. Las soluciones preparadas deben ser esterilizados en autoclave y luego se vaya a utilizar.
- Para las placas de agar-agar LB bacto (1,5% w / v) se debe añadir a la LB-medio anteriores a la esterilización.
- Calentar el LB-agar en el microondas hasta que el LB-agar se disuelva por completo. Deje que la solución se enfríe hasta que la botella se puede tocar con....
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Discusión
El número de células sembradas para la infección y se utiliza el MOI correspondientes, dependen fundamentalmente de las líneas celulares en observación y su velocidad de crecimiento. Para encontrar números de celular óptimo para la siembra, pre-experimentos para determinar la velocidad de crecimiento son muy recomendables. Además de esto, las MOI diferentes deben ser probados debido a la limitada se extiende a que las células pueden resistir la invasión bacteriana sin morir de estrés. El punto óptimo de tiempo donde la .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El trabajo fue financiado por el subsidio no. 01GU0615 del "Bundesministerium für Forschung und Technologie de Alemania (BMBF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amfotericina B | Biochrom AG | A2612 | |
| Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (PBS 10x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | Sin catálogo disponible, pedido directo | |
| Gentamicina | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen GmbH | Contiene 5.000 unidades de penicilina (base) y 5.000 μg de estreptomicina (base)/ml utilizando penicilina G (sal sódica) y sulfato de estreptomicina en solución salina al 0,85 %. | |
| Cloruro de sodio | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Triptona | Difco Laboratories | 211705 | |
| Extracto de levadura | Difco Laboratories | 212750 |
Referencias
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H.
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Reimpresiones y permisos
