Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

Resumen

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas miocardio In vivo Se describen.

Resumen

Este protocolo proporciona los métodos para la preparación de un inyectable de la matriz extracelular (ECM) de gel para el infarto de aplicaciones de ingeniería de tejidos. En pocas palabras, el tejido descelularizada es liofilizada, se muele, se digiere enzimáticamente, y luego llevados a un pH fisiológico. La liofilización elimina todo el contenido de agua de los tejidos, dando lugar a ECM seco que puede ser molido en un polvo fino con un pequeño molino. Después de la molienda, el polvo de ECM es digerido con pepsina para formar una matriz de inyectables. Después del ajuste a un pH de 7.4, el material de la matriz líquida se puede inyectar en el miocardio. Los resultados de los ensayos de caracterización previos han mostrado que los geles matriz obtenida a partir de tejido de miocardio y pericardio descelularizada retener los componentes nativos ECM, incluyendo diversas proteínas, péptidos y glicosaminoglicanos. Dado el uso de este material para la ingeniería de tejidos, en la caracterización in vivo es especialmente útil, aquí, un método para realizar una inyección intramural en el ventrículo izquierdo (VI) de la pared libre se presenta como una forma de analizar la respuesta del huésped a la matriz de gel en un modelo de animal pequeño. El acceso a la cavidad torácica se obtiene a través del diafragma y la inyección se hace un poco por encima del vértice de la pared libre del VI. El origen biológico andamio puede ser visualizado por biotina-etiquetado antes de la inyección y luego teñir secciones de tejido con rábano picante y conjugado con peroxidasa neutravidin y visualización mediante diaminobencidina (DAB) tinción. Análisis de la región de inyección también se puede hacer con la tinción histológica e inmunohistoquímica. De esta manera, los geles de la matriz ya examinada pericardio y miocardio, se mostró a formar redes de fibra, porosa y promover la formación de vasos en la región de la inyección.

Protocolo

1. Pre-procesamiento de los tejidos de preparación

1. Antes de utilizar este protocolo, se debe tener ya descelularizada el tejido de elección. Para este ejemplo, fresca de porcino y muestras humanas pericardio descelularizada utilizando enjuagues hipotónica e hipertónica en agua desionizada (DI) y dodecilsulfato sódico (SDS).
2. En concreto, primero se deben lavar el pericardio porcino en agua DI durante 30 minutos, luego revolver continuamente en SDS al 1% en tampón fosfato salino (PBS) durante 24 horas, seguido de un 5 horas de agua DI enjuague. Para pericárdica humanos, primero enjuague con agua DI durante 30 minutos, luego revolver continuamente en SDS al 1% en PBS durante 60-65 horas, seguido de una noche a la mañana di enjuague. Eliminar todos los ejemplares de su solución final y aclarar de nuevo bajo el chorro de agua DI ^1.
3. Para verificar descelularización, extraer una pequeña cantidad, fresco congelarlo en un medio de octubre de congelación, y tener 10 secciones de tejido m cada 100 m en toda la muestra para el examen a través del análisis histológico, como se informó anteriormente ^34-36.
4. El uso de hematoxilina y eosina (H & E) para examinar el tejido de la ausencia de núcleos. También se podría utilizar un fluorescente Hoescht 33342 mancha (1,0 mg / mL) de ADN para verificar la H & E produce, brevemente, fijar las secciones, rehidratar y enjuague con agua ya las manchas durante 10 minutos y luego enjuague bien y guardar en la oscuridad. Alternativamente, se puede utilizar un kit como la sangre y el kit de Qiagen DNeasy tejido, que está diseñado para cuantificar el contenido total de ADN de una muestra.

2. Preparación de inyectables ECM

1. Liofilización
   1. Después de una preparación adecuada, congelar las muestras descelularizada con nitrógeno líquido o mediante el almacenamiento a -80 ° C. Liofilizar las muestras hasta que esté completamente seco. Dependiendo de su sistema y el contenido de agua de las muestras, esto puede tomar de 12 a 72 horas.
2. Molienda
   1. Una vez completamente seco, un molino Wiley Mini se utiliza para moler el ECM seca en un polvo fino. Seleccione el tamaño del tamiz adecuado para sus propósitos, aquí, la malla de calibre 40 se utiliza. Una vez que la mayoría de la muestra ha llegado a través del filtro, retire el recipiente de recogida con el polvo molido ECM. Si sólo hay una pequeña muestra, el resto de la muestra puede ser extraída de la planta en una variedad de formas, aquí, un Q-tip se utiliza para eliminar el ECM atrapado detrás de las hojas de la planta estacionaria.
   2. Asegúrese siempre de que el molino está limpio y libre de residuos. También es importante asegurarse de que tanto el molino y la muestra está totalmente seca, y cualquier resto de humedad hará que el ECM para agregar y se agrupan, la prevención de la molienda de éxito. El ECM puede recoger la humedad del aire y por lo tanto deben ir directamente desde el liofilizador a la fábrica.
3. Digestión
   1. Para formar el ECM inyectables, el polvo se digiere la pepsina. El siguiente protocolo fue modificado a partir de Freyetes, et al. (2).
   2. Es importante mantener un producto tan estéril como sea posible, ya que se inyecta en vivo y la contaminación puede causar complicaciones. Por lo tanto, utilizar los viales estériles y con un peso cucharas y filtro de todas las soluciones antes de su uso. Un paso de liofilización después de la molienda y antes de la digestión también ayudará a mantener la esterilidad.
   3. Pesar la cantidad necesaria de polvo de ECM en un vial de centelleo apropiado. Por el volumen total de menos de 1 ml, se recomienda que utilice un vial de 2 ml y para grandes volúmenes, a 20 ml frasco. Esto asegura que hay suficiente líquido en el fondo del frasco para mezclar con eficacia.
   4. Pesar la cantidad deseada de la pepsina en un vial de centelleo. Añadir 0,1 M de tal manera que la pepsina a una concentración de 1 mg / ml de HCl. Asegúrese de que la pepsina se haya disuelto completamente (sin partículas) antes de usar esto puede ser acelerada por agitación la solución de pepsina.
   5. Añadir la solución de pepsina / HCl en el vial de centelleo con el polvo de ECM para que el ECM se encuentra en una concentración de 10 mg / ml.
   6. Mezcle una solución de forma continua durante 60-65 horas, periódicamente raspando los lados del vial con una cuchara o una espátula de peso.
4. Regulación del pH
   1. Este paso se realiza para llevar el material de la matriz líquido a pH fisiológico y para inactivar la pepsina, evitando que cortando el ECM más. De nuevo, asegúrese de usar las soluciones de filtrado hecho con agua Millipore.
   2. 1 M se añade NaOH a 1 / 10 del volumen original. Probar el pH en este punto y añadir pequeñas cantidades (2-10 l) de NaOH o HCl tales que el pH deseado (7,4) se alcanza. Lleve un registro de todas las pequeñas cantidades añadido para la neutralización o eliminarse para medir el pH. Una vez que la solución ha sido neutralizada, añadir 10x PBS a 1 / 10 del volumen final (1 / 9 del volumen actual). Determinar la concentración de la ECM inyectable y luego añadir 1x PBS para llegar a co final deseadancentration, aquí 6 mg / ml.
   3. Caracterización de la ECM inyectable se puede hacer a través de SDS-PAGE, ensayo colorimétrico Blyscan GAG, y espectroscopia de masas.
   4. En este punto, el material de la matriz puede ser inyectado en vivo para formar un andamiaje para ingeniería de tejidos del miocardio.
5. Biotina-Etiquetado
   1. El ECM se pueden etiquetar con biotina antes de la inyección para una fácil visualización de la ECM inyecta.
   2. Prepare una solución de 10 mM de biotina y añadir a la ECM inyectable en una proporción de 0.3mg/mg. El ECM se debe a la concentración deseada para la inyección. Si se inyectan en una concentración de 6 mg / ml, añadir 40 Biotina L por 1 ml de ECM. Antes de la inyección, mantener la solución de biotina-ECM en hielo durante al menos 1 hora.
6. Todos los pasos del proceso se puede realizar a temperatura ambiente. Para mantener la matriz inyectable de gelificación, el paso de ajuste del pH se puede hacer sobre el hielo.

3. Las inyecciones de miocardio

1. Inyección de preparación
   1. De las ratas hembras (225-250 g) se usa aquí, el 75 inyecciones de L de pH 7,4 inyectable ECM se prepararon en 0,1 ml jeringas con punta de agujas de calibre 30. Si las ratas macho (375-400 g) fueron utilizados, 90 l podría ser inyectada.
   2. Todos los suministros quirúrgicos deben ser esterilizados antes de la cirugía, aquí usamos una bolsa de autoclave quirúrgica que contiene todas las herramientas necesarias.
2. En el día de la cirugía, una Harlan Sprague-Dawley, ratas se anestesia con isofluorano al 5%, intubación con un otoscopio, y luego se mantuvo en el 2,5% isoflurano durante todo el procedimiento.
3. Añadir ungüento de lágrimas artificiales para los ojos del animal para proteger contra la sequedad y el cabello. Administrar 3 ml de solución de Ringer lactato para la hidratación durante la cirugía. Esto debe hacerse mediante una inyección subcutánea en el abdomen inferior.
4. Colocar el animal en decúbito supino sobre la mesa de operaciones y la cinta suavemente las extremidades. Use tijeras para quitar el pelo en el abdomen y el pelo de vacío libre antes de fregar.
5. Hacer una serie de pequeñas inyecciones (aproximadamente 50 l cada uno) de lidocaína al 2% a lo largo de una diagonal desde el proceso de zyphoid a la baja del lado derecho del abdomen. Luego frote tres veces con betadine, comenzando en el centro y hacia el exterior. Repita con el 70% de etanol. Cubrir al animal con un paño quirúrgico, con una ventana circular pre-hechas, seguro con pinzas toalla, si es necesario.
6. El uso de un bisturí N º 10 hacen una incisión de 3-4 cm de la apófisis xifoides a la parte inferior del lado derecho del abdomen. Localizar proceso xifoides y diseccionar verticalmente hacia abajo a través del músculo a la derecha, teniendo cuidado de evitar el vaso grande de la derecha. Una vez que ha diseccionado a través del músculo, use tijeras para cortar lateralmente a través del músculo, dejando al descubierto el diafragma. Tenga cuidado de evitar el hígado.
7. Utilizando una longitud de 36 pulgadas de 3-0 sutura Vicrile y un par de pinzas hemostáticas, unidad de una aguja a través del proceso de zyphoid y tirar de la sutura a medio camino. Cinta de los extremos de la sutura en conjunto y fijar que a un punto por encima y detrás del animal esencialmente el levantamiento de la zyphoid y exponer el diafragma. Con otra longitud de 36 pulgadas de 3-0 sutura Vicrile, la unidad de una aguja a través del músculo más cercano a la apófisis xifoides y, una vez más, pasar a través y fijar los extremos a otro punto a la derecha de la mesa de operaciones, exponiendo completamente la cavidad quirúrgica.
8. En este punto, usted debería ser capaz de ver el corazón a través del diafragma. El uso de un pequeño par de dientes de rata microforceps, toma el centro del diafragma, tire de él hacia usted y hacer una pequeña incisión con tijeras de punta roma. Es muy importante utilizar unas tijeras muy contundente con el fin de evitar meter los pulmones. Una vez que el agujero se ha hecho, los pulmones, se retrae, lo que le permite hacer una incisión de 2-3 cm verticalmente a través del diafragma para visualizar el corazón.
9. Inserte una de 3 pulgadas Q-tip a la izquierda de la cavidad para empujar a los pulmones del camino. Utilice una abrazadera toalla para asegurar el Q-tip en su lugar. Utilice otro Q-tip para mover el pulmón derecho del camino a fin de localizar el saco pericárdico. Con un par de microforceps y un par de grandes pinzas dentadas, corte a través del saco pericárdico, la exposición del ápice del corazón. Si el animal ha sido sometidos previamente a un procedimiento de miocardio, el pericardio ya va a estar ausente.
10. Coge la punta del corazón con la microforceps diente de ratón y se inyecta el material de la matriz líquida de un tercio de la subida desde el vértice. Insertar la aguja paralela a la superficie del epicardio y se inyecta con el borde biselado de la aguja a la izquierda. Asegúrese de evitar la gran vena cardíaca. Espere un par de segundos antes de retirar la aguja. Usted debe ver a un blanqueamiento de los tejidos en el sitio de la inyección.
11. Limpieza de sangre en la cavidad y retire la abrazadera toalla y Q-tip que sostenía el pulmón derecho. Use microhemostats curva y la ratadiente microforceps para cerrar el diafragma. Haga un nudo inicial y luego usar las pinzas dentadas y microhemostats para cerrar el diafragma con una sutura continua y una aguja cónica. Antes de cerrar completamente, inserte PE160 tubos de succión y el uso de una jeringa de 10 ml para evacuar la cavidad torácica cuando la sutura se tensa.
12. Cuando está debidamente evacuada y cerrada, el diafragma debe ser cóncava. Un diafragma convexo indica que aún hay aire en la cavidad.
13. En este punto el isoflurano puede ser rechazada al 1%.
14. Sacar los dos puntos de sutura 3-0 Vicrile la celebración de la cavidad abierta. El uso de agua estéril para hidratar el músculo, eliminando el exceso de distancia con un Q-tip o una gasa estéril. Use una nueva longitud de 3-0 sutura para cerrar la capa muscular con suturas intermitentes.
15. En este punto, el isoflurano se puede apagar.
16. Limpie el área con agua estéril y grapas utilizar para cerrar la piel. Si grapas interferir con el estudio, 5-0 sutura prolina también se puede utilizar. En ese caso, utilice un corte inversa (RC) para cerrar la aguja de la piel con suturas intermitentes. En ambos casos, la mancha de pegamento quirúrgico más se cierra la incisión.
17. Usar un Q-tip para ungir el lugar de la incisión con un ungüento antibiótico triple.
18. Que el animal pueda recuperarse bajo oxígeno al 100%.
19. Cuando los animales comienza a respirar en todo el ventilador, retire el tubo de la tráquea.
20. Una vez que los animales son esternal, administrar una inyección subcutánea de 0,05 mg / kg de hidrocloruro de buprenorfina y devolverlos a su jaula con una toalla estéril.
21. Los animales deben recibir después de la operación de observación y cuidado.
22. En los puntos de tiempo de interés, los animales son sacrificados y los corazones para su análisis. Corta las secciones transversales del eje se toman y se puede teñir con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis de los tejidos bruto. En los puntos de tiempo, la región inyectada aparecerá como una red de color rosa y fibroso que se ha extendido intersticial. En momentos posteriores, se observará un flujo de células y una eventual degradación de la matriz de inyección después de 2 a 3 semanas. Si el ECM fue marcado con biotina antes de la inyección, puede ser más directa visualizado por tinción de la biotina con el conjugado HRP-estreptavidina. La tinción inmunohistoquímica puede ser utilizado para identificar células o estructuras específicas de la región de la inyección, aquí las diapositivas se han co-teñidos con un isolectina FITC-conjugado que se une a las células endoteliales y verde fluorescente y un anticuerpo anti-actina de músculo liso con una secundaria AlexaFluor anticuerpos que los informes del SMC en rojo.

4. Resultados representante

Caracterización previa de los materiales de matriz preparada de esta manera demostró la retención de una gran variedad de macromoléculas. En concreto, múltiples proteínas fibrosas y glicoproteínas fueron identificados a través de espectrometría de masas (Tabla 1). Si los materiales de matriz procesados ​​de acuerdo con este protocolo se encuentran ya no contienen un complejo conjunto de macromoléculas, podría ser que el protocolo descelularización empleado es demasiado dura. Una vez totalmente liofilizado, el secado ECM pericárdico parece muy rígido, papel arrugado. Otros tipos de tejidos se asemejan a los cacahuetes de embalaje. Si bien molido, el MEC debe caer por el tamiz y se recogerán en el frasco en la parte inferior. Si hay humedad presentes en la muestra, el ECM se agrupan y se atascan en la cámara de molienda. Después de la digestión, la solución ECM debe ser de un color lechoso y completamente libre de partículas visibles. También será ligeramente más viscoso que el solo HCl. Si el ECM no digiere bien, todavía habrá partículas de mayor tamaño en el vial, como alternativa, el ECM se puede bloquear de la solución. Después de ajustar el pH, no hay ningún cambio visible en la solución, y el ECM sigue siendo un líquido turbio, homogéneo. Si comienza a gel, la viscosidad aumenta y será difícil o imposible de extraer el material en una jeringa. Si esto sucede, realice el paso de ajuste de pH en el hielo, con pre-enfriado soluciones. Una vez que las inyecciones se han preparado, mantenerlos en hielo hasta su uso. Si la inyección se realiza correctamente, la región alrededor de la punta de la aguja blanquea y un pequeño bolo es visible. Si esto no se observa, la inyección puede haber entrado en la cámara en lugar de en la pared. Cuando la sutura de los animales hasta después de la inyección, el cierre de cuidado de la membrana es el paso más importante. Si se hace correctamente, el diafragma se firme contra los pulmones y aparecerá cóncavo. Si hay algún aire que queda dentro de los pulmones, el diafragma se mantendrá convexa, o tener un área en la que se hincha. Al examinar la histología de la región de la inyección en un punto de tiempo temprano (30 minutos a 4 horas después de la inyección), uno debe ver a un área rosada, fibrosa que carece de células éste es el material de la matriz a montar después de la inyección (Figura 2) . La red a menudo se disemina intersticial y puede estar presente a lo largo de muchas secciones. A possexplicación ible para ver sólo un área muy pequeña de la matriz del gel es que una parte de la inyección se perdió el objetivo de intramuros y se inyectarse en la cámara de baja tensión o escape de la ubicación de la inyección. Además, dependiendo del tiempo de gelificación, la difusión intersticial puede variar.

Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) resultados. (A) estándar de peso molecular. (B) cola de rata de colágeno tipo I (2,5 mg / ml) en comparación con la humana solubilizada (C) y porcino (D) pericárdico ECM (7 mg / mL). Tenga en cuenta la presencia de colágeno, así como varias otras proteínas y péptidos en las muestras de la matriz del pericardio.

Tabla 1. Componentes de ECM identificado con la espectroscopia de masas.

Figura 2 inyecciones de miocardio:. Gelificación en vivo. H & E tinción de los derechos humanos (A) y porcino (B) inyecciones pericárdico matriz de gel que tienen en vivo después de 45 minutos. Las flechas indican la ubicación de la matriz, manchada de rosa más claro que el miocardio. Barra de escala es de 500 micras.

Figura 3. Infiltración de células vasculares. Manchas fluorescentes para los buques en el ser humano inyectado (CA) y porcino (DF) geles matriz en dos semanas. Las células endoteliales son etiquetados verde (A, D), mientras que las células del músculo liso están marcados de color rojo (B, E). Imágenes fusionadas se muestran en la barra de C y F. Escala es de 100 micras. Las líneas de puntos blancos indican la zona de la inyección de la matriz, según lo determinado por el análisis de H & E de la sección cercana.

Figura 4. Las células madre dentro de la región de la inyección de la matriz. A Hoescht tinción de los núcleos (azul) y c-kit (verde) identifica las células madre en el ser humano (A) y porcino (B) las regiones de la inyección de la matriz. Barra de escala es de 50 micras.

Discusión

Este método permite la generación de origen biológico, andamios inyectables para la ingeniería de tejido miocárdico. Aunque estos métodos fueron desarrollados inicialmente para la fabricación y las pruebas in vivo de una matriz de gel de miocardio y que aquí se presenta con una matriz de gel pericárdico, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido, siempre que el tejido puede ser apropiada descelularizada. Descelularización se debe realizar y verificados antes de la utilización d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos:
Pepsina	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Liofilizado
Biotina	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidina-HRP	Thomas Scientific	21130
Equipamiento:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Liofilizador Labconco	Labconco Corp.	7670520
Suministros quirúrgicos:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Solución de Ringer con lactato	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaína, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Clorhidrato de buprenorfina	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Pomada ocular artificial	Fisher Scientific	NC9860843
Pomada triple antibiótica	Fisher Scientific	19082795
Isoflurano	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscopio	MWI Veterinary Supply	008699
Llave de paso	MWI Veterinary Supply	006245
Sutura Vicryl 3-0	MWI Veterinary Supply	J327H
Sutura Proline 5-0	MWI Veterinary Supply	s-1173
Aguja de corte inverso (RC)	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostatos	Fine Science Tools	13013-14
Pinzas microdentadas	Fine Science Tools	11084-07
Bisturí número 10	Fine Science Tools	10110-01
Tijeras romas	Fine Science Tools	14108-09
Tijeras curvas afiladas	Fine Science Tools	14085-08
Pinzas grandes con dientes	Fine Science Tools	1106-12
Tubo de succión PE160	BD Biosciences	427430
Afeitadoras	MWI Veterinary Supply	21608
Grapas quirúrgicas/ensartador	Ethicon Inc.	PRR35
Suministros generales:
Placas agitadoras
HCl 0,1 M
NaOH 1 M
PBS 10x
PBS 1x
Etileno al 70%
Jeringas de 0,1 mL
Jeringa de 10 mL
Hisopos
Adhesivo quirúrgico
Campos quirúrgicos
Pinzas para toallas
Aspirador pequeño portátil