Después de la exposición al antígeno, las subpoblaciones de linfocitos B activados sufren un proceso conocido como recombinación de cambio de clase (CSR) para producir isotipos de anticuerpos con diferentes funciones efectoras. El protocolo se describe en este informe se explica cómo la RSE puede ser inducida y analizados In vitro A los efectos de estudiar la función de las células B.
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Artículo de método
Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunidad humoral es la rama del sistema inmune que mantiene las células B y mediado a través de la secreción de anticuerpos. Tras la activación de células B, el locus de la inmunoglobulina se somete a una serie de modificaciones genéticas para alterar la capacidad de unión y función efectora de los anticuerpos secretados. Este proceso se destaca por un evento de recombinación genómica conocida como recombinación de cambio de clase (CSR) en el que se sustituye el isotipo IgM por defecto para un anticuerpo de IgG, IgA o IgE. Cada isotipo posee distintas funciones efectoras con lo que la RSC crucial para el mantenimiento de la inmunidad.
Diversificación de la locus de la inmunoglobulina es mediada por la enzima citidina deaminasa inducida por activación (AID). Un vídeo esquema que describe este proceso en detalle está disponible en línea (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). La actividad de la AID y la vía de RSC son comúnmente estudiados en la evaluación de la función de las células B y la inmunidad humoral en ratones. El protocolo se describe en este informe se presenta un método de aislamiento de células B del bazo murino y posterior estimulación con lipopolisacárido bacteriano (LPS) para inducir el cambio a la clase IgG3 (para otros isotipos de anticuerpos ver Tabla 1). Además, la tinción de células fluorescentes de tinte carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) se utiliza para controlar la división celular de las células estimuladas, un proceso crucial para el cambio de isotipo 1, 2.
La regulación de la AID y el mecanismo por el que la RSE se produce aún no están claros y por lo tanto en ensayos in vitro de cambio de clase proporcionan un método confiable para las pruebas de estos procesos en modelos de ratones diferentes. Estos ensayos se han utilizado anteriormente en el contexto de la deficiencia de genes utilizando ratones knockout 3. Además, in vitro el cambio de las células B puede estar precedido por la transducción viral para modular la expresión génica mediante ARN derribo o la expresión del transgén 4-6. Los datos de este tipo de experimentos han impactado a nuestra comprensión de la actividad de AID, la resolución de la reacción de la RSE, y la inmunidad mediada por anticuerpos en los ratones.
Protocolo
Paso I: Aislamiento de las células B del bazo a través de enriquecimiento magnética
- Ratones experimentales deben ser mayores de 8-12 semanas para asegurar plena maduración del sistema inmunológico.
- Sacrificar al ratón por dislocación cervical y de inmersión en etanol al 70%. Extraer quirúrgicamente el bazo al realizar una incisión a través de la piel y el músculo del hipocondrio izquierdo del abdomen y lo cortó en tres trozos grandes en tampón fosfato salino (PBS). Asegúrese de que todas las herramientas y los reactivos son estériles.
- Con el extremo de caucho de un émbolo de una jeringa ml, suavemente mezcla del bazo a través de un filt....
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Discusión
El protocolo descrito anteriormente proporciona un estándar de ensayo para analizar la expresión de la AID y la función durante el cambio de clase de primaria de las células B murinas. Este protocolo utiliza bacteriana LPS para inducir el cambio de IgM a IgG3, a pesar de las modificaciones a los medios de estimulación se puede hacer para inducir el cambio a otros isotipos (que se resumen en la Tabla 1 8, 9).
Hemos tomado nota de que, por razones aún desconocidas, suero bovino feta.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Estamos agradecidos con el laboratorio de Martin útil para los debates. Esta publicación está apoyada por una subvención del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (MOP-89783). AM es apoyado por una investigación de Canadá Premio Cátedra de Nivel II.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Kit de enriquecimiento de células B de ratón EasySep | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Tubos de poliestireno | BD Biosciences | 352058 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Kit de proliferación celular CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| Suero de becerro bovino | Hyclone | SH30072.03 | |
| Medio de cultivo RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolisacáridos de Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapto–etanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Suero fetal bovino | Hyclone | SH30396.03 | |
| Suero de ratón normal | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Ratón purificado anti-ratón CD16/CD32 (Bloqueador de Fc de ratón BD) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anticuerpo monoclonal de rata anti-IgG3 de ratón | BD Biosciences | 553401 |
Referencias
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....
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Reimpresiones y permisos
