Se describe el procedimiento para preparar etapas Drosophila Embriones para la visualización del sistema nervioso embrionario durante la embriogénesis.
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Artículo de método
Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
El embrión de Drosophila es un sistema modelo atractivo para la investigación de las bases celulares y moleculares del desarrollo neuronal. A continuación se describe el procedimiento para la visualización de Drosophila sistema nervioso embrionario utilizando anticuerpos contra las proteínas neuronales. Ya que toda la embrionaria sistemas nervioso periférico nervioso central y están bien caracterizados a nivel de células individuales (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), cualquier aberración que estos sistemas pueden identificar fácilmente el uso de anticuerpos a diferentes proteínas neuronales. Los embriones en desarrollo se reúnen en ciertos momentos para asegurarse de que los embriones se encuentran en las etapas de desarrollo adecuado para la visualización. Después de la recolección, las capas externas del embrión, el corion y la membrana de la envoltura vitelina que rodea el embrión, se retiran antes de la fijación. Los embriones se incuban con anticuerpos neuronales y se visualizan con fluorescencia utilizando anticuerpos secundarios marcados. Los embriones en etapas 12-17 se visualizan para acceder al sistema nervioso embrionario. En la 12 ª etapa de la banda germen del SNC se inicia el acortamiento y la etapa 15 el patrón definitivo de la comisura se ha logrado. Por la etapa 17 de los contratos del SNC y SNP está completamente desarrollado (Campos-Ortega et al. 1985). Así, los cambios en el patrón del SNP y SNC pueden ser fácilmente observados durante estas etapas de desarrollo.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos
- Prepare el tampón PEMFA utilizando canalizaciones con 100 mM, EGTA 2 mM y 1 mM MgSO 4. Ajustar el pH de la solución a 7,0. El buffer PEMFA es esterilizado por filtración y se almacenan a 4 ° C.
- Prepare PBT mediante la adición de 1 ml de Triton X-100 a 100 ml 1x PBS (tampón fosfato salino) (pH 7,0). Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 5% de BSA (albúmina de suero bovino) con un 0,01% NaAcide en 1X PBS (pH 7,0).
- Prepare la solución salina con 0,7% NaCl y 0,03% Triton X-100 en agua destilada.
- Preparar el fijador mediante la combinación de 4 partes de búfer PEMFA con formaldehído parte ....
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Discusión
El embrión de Drosophila es un potente sistema para la investigación de los cambios celulares y moleculares durante el desarrollo neuronal. En este protocolo se ha demostrado la forma de preparar todo el montaje embriones para inmunohistoquímica. Nos hemos adaptado a partir de este protocolo el protocolo descrito en Carroll y Scott, 1985. Este protocolo también se puede adaptar a otra prueba de anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerpos se debe hacer. Además, los defectos del desarrollo emb.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| formaldehído al 37% | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón | Invitrogen | A-11004 | |
| Medio de montaje Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 |
Referencias
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of th....
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Reimpresiones y permisos
