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1. Preparación de los reactivos
- Prepare la preparación de amortiguación disección mediante la adición de los siguientes compuestos: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mM y 36 mM de sacarosa en 1000 ml, el pH a 7,2 y el filtro de esterilización.
2. Preparación para la disección
- Cubo Siligard: El gel se corta a aproximadamente una pulgada de ancho, una pulgada de largo y aproximadamente 1 cm de alto. El cubo de gel se coloca en un portaobjetos de vidrio durante la disección. Los cubos se pueden utilizar más de una vez.
- Pins: pins utilizados para la disección debe ser muy corto. La parte inferior de pasadores fuerte minutien funciona mejor en la disección.
- Necesidad de una tijeras afiladas primavera microdisección.
- Necesita dos pinzas de punta fina.
3. Recolección de larvas
- Vagando 3 de larvas que son expresión de una proteína GFP etiquetados vesículas se recogen en una placa de Petri.
- Las larvas se lavan con agua desionizada para deshacerse de todos los alimentos.
4. La disección en vivo de larvas
- Una larva se transfiere al cubo de gel de la disección de un portaobjetos de vidrio. Larva se encuentra inmersa en un tampón de disección.
- Larva se consumía en el anterior y posterior uso de dos pines muy bien con el dorso hacia arriba.
- El uso de tijeras de microdisección, una pequeña incisión en la línea media cerca del extremo posterior. A partir de esta incisión se hace una incisión a través de la anterior. El uso de dos pines, el pin de la cutícula corte en los bordes laterales.
- Añadir una gota de la disección de buffer. Retire con cuidado el intestino, los intestinos y los órganos de grasa con fórceps. La mayoría de estos tejidos que normalmente se escurre durante el corte dorsal.
- Vuelva a colocar el tampón con el tampón fresco de disección. La larva no debe estar seca y deben estar constantemente en la disección de amortiguamiento.
- Incubaciones con los marcadores en vivo o MitoTracker LysoTracker se llevan a cabo en este momento, diluyendo el marcador en vivo en un tampón de disección. Después de la incubación de los marcadores en vivo lavar la larva diseccionado varias veces (cinco lavados rápidos) con tampón fresco de disección.
- Después de reemplazar el último lavado, empujar las clavijas en el syligard y cubreobjetos de inmediato. Las larvas ya está listo para la observación.
5. Imágenes en vivo de larvas disecadas
- Coloque el cubreobjetos y gel en la platina del microscopio y la imagen mediante un microscopio invertido.
- Utilizamos un lente de 100x a las vesículas de imagen etiquetada dentro de las larvas nervios segmentarios. La expresión de GFP en los cuerpos celulares del ganglio ventral se evalúa en primer lugar antes de los nervios segmentarios se va a examinar. Si la tinción GFP robusta que se observa en los cuerpos celulares en el ganglio ventral, los nervios están a continuación, imágenes y para su evaluación.
- El uso de un sistema de visión dual con filtros para PPC / YFP o RFP YFP / software y división de opiniones que puede, simultáneamente, imágenes de dos proteínas marcadas en vivo.
6. Resultados representante
Figura 1:. Una imagen representativa que muestra muchas vesículas axonal en muchas pistas axonal en el nervio segmentario larvas Nota las manchas de la GFP, lo que representa la acumulación axonal.
Figura 2: Una imagen representativa que muestra una pista única axonal con muchas vesículas axonal en el nervio segmentario larval.