La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.
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Artículo de método
La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
Hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras se obtienen generalmente de la médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica y se utilizan para estudiar la hematopoyesis y leucemogénesis. Tienen la capacidad de diferenciarse en linajes linfoides y mieloides. La formación de colonias de células (CFC) de ensayo se utiliza para estudiar la proliferación y el patrón de diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas de su capacidad de formar colonias en un medio semisólido. El número y la morfología de las colonias formadas por un número fijo de células de entrada proporcionan información preliminar sobre la capacidad de los progenitores para diferenciarse y proliferar. Las células pueden ser cosechadas a partir de distintas colonias de la placa entera para evaluar aún más sus números y los estados de diferenciación mediante citometría de flujo y la evaluación morfológica de Giemsa diapositivas. Este ensayo es útil para evaluar la diferenciación mieloide linfoide, pero no. El mieloide término en este contexto se utiliza en su sentido más amplio para abarcar linajes granulocítica, monocítica, eritroide y megacariocítica.
Hemos utilizado este ensayo para evaluar los efectos de los oncogenes en la diferenciación de las células humanas primarias CD34 + derivadas de sangre periférica. Para este propósito las células se transducen con la construcción de control, ya sea por retrovirus o un concepto que expresa el oncogén de interés, en este caso-Nup98 Hoxa9. Contamos con un vector retroviral de uso común, MSCV-IRES-GFP, que expresa un mRNA bicistrónico que produce el gen de interés y un marcador GFP. Las células son pre-activado por el aumento en la presencia de citocinas durante dos días antes de la transducción retroviral. Después de dos días, las células GFP + se encuentran aisladas por la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y se mezcla con un medio semisólido que contiene metilcelulosa, complementado con las citocinas y se incuban hasta que las colonias aparecen en la superficie, por lo general 14 días. El número y la morfología de las colonias están documentados. A continuación se retiran las células de las placas, se lavan, se cuentan y sometidos a la citometría de flujo y el examen morfológico. La citometría de flujo con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie celular expresadas durante la hematopoyesis proporciona información sobre el linaje y la etapa de maduración. Los estudios morfológicos de las células individuales bajo un microscopio después de Wright-Giemsa tinción de proporcionar más información con respecto a la descendencia y la maduración. Comparación de las células transducidas con el vector de control de vacío a los transducidas con un oncogén revela los efectos del oncogen en la diferenciación hematopoyética.
Protocolo
1. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
- Preparar soluciones estériles acciones 1000x de Fms relacionados con la tirosina quinasa 3 (FLT-3) ligando, de granulocitos / macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF), factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), la interleuquina (IL) -3 , y la IL-6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare una solución estéril de acciones Retronectin (1mg/ml), también de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Divide estas soluciones madre en pequeñas alícuotas y mantener a -20 ° C para evitar repetidos de congelación-descongelación.
- Prepare FBS al 2% en IMDM.
- Preparar el medio IMDM c....
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Discusión
El ensayo de CFC se ha utilizado ampliamente para determinar la proliferación y diferenciación de los patrones de progenitores hematopoyéticos y para estudiar los efectos de los oncogenes (4, 5). Tiene la ventaja sobre los cultivos líquidos de ser un ensayo clonal, de tal manera que las colonias representan la progenie de un solo progenitor y puede ser eliminado de forma individual para su posterior análisis. La limitación de la prueba de CFC es que no es adecuado para la detección de los progenitores más inmaduros o cé.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias al Alvin J. Siteman Cancer Center en la Universidad de Washington Escuela de Medicina y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, por el uso del Núcleo clasificador de alta velocidad de la célula, que proporcionó el equipo de citometría de flujo y los servicios de clasificación. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 HL082549 HL084179 y K02 (NRY). El Siteman Cancer Center es apoyado en parte por un apoyo del NCI Cancer Center de Grant P30 CA91842.....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| SFB | Tecnologías de Células Madre | 06150 | |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030 | |
| Penicilina/Estreptomicina (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| ligando FLT-3 | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectina | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Solución de azul de tripano (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Tecnologías de Células Madre | 04445 | |
| Medio enriquecido con metilcelulosa humana | R&D Systems | HSC005 | |
| Tinción de Wright/Giemsa | Harleco | 64571 | |
| Solución tampón fosfato, pH 6,4 - fórmula Giordano | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Suero normal de ratón | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-CD11b humana ficocianina–conjugado con ritrina | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-CD33 humano conjugado con aloficocianina | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Humano CD45 ficoeritrina–rythrin-Cy7-conjugado | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-CD71 humana ficoeritrina–conjugado con ritrina | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-CD235a humana conjugada con aloficocianina | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Humano CD45 ficocianina–rythrine-Cy7-conjugado | BD Biosciences | 557748 | |
| Placas de cultivo celular de 24 pocillos no tratadas | BD Biosciences | 35-1147 | |
| placa de 30 mm no tratada | Tecnologías de Células Madre | 27150 | |
| placa de cultivo celular de 100 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Placas de puntuación cuadriculadas | Tecnologías de Células Madre | 27500 | |
| Tubos cónicos de centrífuga de 15 ml | BD Biosciences | 35-2097 | |
| Tubos centrífugos de 50 ml | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Jeringas de 3 ml | Tecnologías de Células Madre | 28240 | |
| punta roma de calibre 16, 1½ aguja de una pulgada | Tecnologías de Células Madre | 28110 | |
| 50 μm CellTrics filtro de células | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocitómetro | Fisher Scientific | 0267110 | |
| cámaras de muestra TPX | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Láminas microscópicas Fisherbrand Superfrost/Plus, precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tarjetas filtrantes Shandon | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Soporte para portaobjetos Shandon Cytospin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μpapel de filtro m | VWR international | 28307-134 | |
| Microscopio invertido | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Cámara para microscopio | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscopio | Olympus Corporation | BX51 | |
| Cámara del microscopio | Olympus Corporation | DP71 | |
| Escáner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Mezclador de vórtice | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Incubadora de cultivo de tejidos | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Centrífuga de banco | Eppendorf | 5810-R | |
| Sistema de purificación de agua | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Referencias
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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Reimpresiones y permisos
