En vivo en el infrarrojo cercano fluorescencia (NIRF) imagen intravascular molecular de placa inflamatoria, un enfoque multimodal de imágenes de la aterosclerosis

Resumen

Se detalla una nueva en el infrarrojo cercano fluorescencia (NIRF) catéter de dos dimensiones de imagen intravascular molecular de la biología de la placa In vivo. El catéter NIRF pueden visualizar procesos biológicos clave, como la inflamación de la presentación de informes sobre la presencia de placa-ávido fluorocromos NIR activable y selectiva. El catéter se utiliza requisitos de ingeniería clínica y el poder y está destinada a la aplicación de las arterias coronarias humanas. El estudio de investigación A continuación se describe una estrategia de imagen multimodal que utiliza una novela In vivo NIRF intravascular del catéter a la imagen y cuantificación de placa inflamatoria en atheromata conejo proteolíticamente activos inflamados.

Resumen

La respuesta vascular a la lesión es una respuesta inflamatoria altamente regulada que se inicia por la acumulación de macrófagos en la pared del vaso, lo que conduce a la formación de placas intraluminales cargadas de lípidos, proliferación de células musculares lisas y estrechamiento progresivo de la luz vascular. La formación de estas placas vulnerables, propensas a la ruptura, es la base de la mayoría de los casos de infarto agudo de miocardio. La compleja cascada inflamatoria molecular y celular está regulada por el reclutamiento de linfocitos T y macrófagos, así como por sus efectos paracrinos sobre las células endoteliales y las células musculares lisas.¹

La imagen molecular en aterosclerosis se ha convertido en una herramienta clínica e investigativa importante que permite la visualización in vivo de la inflamación y otros procesos biológicos. Varios ejemplos recientes demuestran la capacidad de detectar placas de alto riesgo en pacientes y evaluar los efectos de los fármacos en la aterosclerosis.⁴ Aunque varias estrategias de imagen molecular (en particular la RM y la PET) pueden visualizar aspectos biológicos de vasos grandes como las arterias carótidas, existen pocas opciones para la imagen de las arterias coronarias.² La aparición de estrategias de imagen óptica de alta resolución, especialmente la fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF), junto con sondas fluorescentes activables, ha aumentado la sensibilidad y ha llevado al desarrollo de nuevas estrategias intravasculares para mejorar la imagen biológica de la aterosclerosis coronaria humana.

La imagen molecular por fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) utiliza luz de excitación con un ancho de banda definido (650-900 nm) como fuente de fotones que, al ser entregada a un agente de contraste óptico o sonda fluorescente, emite fluorescencia en la ventana del infrarrojo cercano, la cual puede detectarse mediante un filtro de emisión adecuado y una cámara acoplada a carga de alta sensibilidad. A diferencia de la luz visible, la luz NIR penetra profundamente en el tejido, se atenúa notablemente menos por los absorbentes endógenos de fotones como la hemoglobina, los lípidos y el agua, y permite altas relaciones señal-fondo debido a la reducida autofluorescencia en la ventana del infrarrojo cercano. La obtención de imágenes dentro de esta «ventana» NIR puede mejorar considerablemente la posibilidad de realizar imágenes in vivo.^2,5

Las proteasas cisteínicas inflamatorias han sido ampliamente estudiadas mediante sondas activables de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF)¹⁰ y desempeñan funciones importantes en la aterogénesis. A través de la degradación de la matriz extracelular, las proteasas cisteínicas contribuyen significativamente a la progresión y complicaciones de la aterosclerosis⁸. En particular, la proteasa cisteínica cathepsina B se expresa altamente y colocaliza con macrófagos en ateromas experimentales de ratón, conejo y humano^3,6,7. Además, la actividad de la cathepsina B en las placas puede detectarse in vivo utilizando una tecnología previamente descrita de fluorescencia en el infrarrojo cercano intravascular unidimensional (1-D)⁶, junto con un agente nanosensor inyectable que consiste en un armazón polimerizado de poli-lisina derivatizado con múltiples fluorocromos NIR (VM110/Prosense750, ex/em 750/780 nm, VisEn Medical, Woburn, MA), lo que produce un fuerte apagado intramolecular en condiciones basales¹⁰. Tras el corte enzimático dirigido por proteasas cisteínicas como la cathepsina B (que se sabe colocaliza con los macrófagos de la placa), los fluorocromos se separan, lo que resulta en una amplificación sustancial de la señal de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF). La detección intravascular de la señal de fluorescencia NIR mediante el catéter intravascular NIRF bidimensional (2D) novedoso utilizado ahora permite una detección in vivo de alta resolución y geométricamente precisa de la actividad de la cathepsina B en placas inflamadas.

La imagen molecular in vivo de la aterosclerosis mediante imágenes NIRF 2D basadas en catéter, en contraposición a un enfoque espectroscópico 1-D previo,⁶ es una herramienta novedosa y prometedora que utiliza la actividad aumentada de proteasas en placas ricas en macrófagos para detectar inflamación vascular.^11,12 El siguiente protocolo de investigación describe el uso de un catéter intravascular NIRF bidimensional para obtener imágenes y caracterizar la estructura de la placa aprovechando aspectos clave de la biología de la placa. Es una plataforma trasladable que, al integrarse con tecnologías de imagen clínica existentes como la angiografía y el ultrasonido intravascular (IVUS), ofrece una técnica única y novedosa de imagen molecular multimodal integrada que permite distinguir ateromas inflamatorios y detectar señales NIRF intravasculares en arterias coronarias de tamaño humano.

Protocolo

En el modelo animal in vivo: La generación de aterosclerosis aortoilíaca Experimental

1) Línea de Base angiografía balón y denudación

1. Antes de obtener la angiografía basal balón y denudación, un conejo blanco de Nueva Zelanda se alimenta un colesterol alto (1%), la dieta durante 1 semana. Este animal se utiliza la relevancia de la traducción como: 1) la aorto-ilíacos buques en los conejos son del mismo calibre que las arterias coronarias humanas (2.5-3.5mm) y 2) la hiperlipemia, el globo de la lesión modelo genera inflamación de la aterosclerosis teniendo similares células inflamatorias (macrófagos ) y moléculas (catepsinas) como en la aterosclerosis humana.
2. Después de la alimentación de colesterol, el animal se anestesia con propofol y la ketamina. A una pulgada incisión ventral línea media del cuello se realiza mediante el uso de un tamaño de 15 bisturí hoja. Utilizando técnicas de disección roma, los músculos debajo de la fascia en el lado derecho de la tráquea está expuesto. El músculo sternocephalicus izquierda se separa a lo largo de su unión del tejido conectivo, y la arteria carótida común derecha está expuesto. La arteria se separa del nervio vago. Bucles de sutura proximal y distal se colocan en la arteria para permitir la retracción y la oclusión. A 1 a 2 mm biselado arteriotomía se hace a través del cual un 5 franceses (diámetro externo 1.67mm) vaina vascular se inserta y heparina (1000μ/mL, ~ 150units/kg) se administra por vía intraarterial a través de la vaina.
3. Medio de contraste (Ultravist) y luego se inyecta (1 a 2 ml) durante un período de dos segundos para obtener una angiografía de control de la aorta distal y ambas arterias ilíacas.
4. Las arterias iliofemoral y la aorta son entonces herido por denudación endotelial. Utilizando los métodos estándar de fluoroscopia, un catéter de Fogarty embolectomía 3FR se coloca en la arteria iliofemoral distal y se infla con 0,3 a 0,5 cc de contraste (50% contrast/50% de solución salina) o el aire. El catéter se retira proximal en el estado infla una distancia a lo largo de la ilíaca derecha y la aorta distal hasta el despegue de la arteria renal izquierda. Después de la denudación del globo, se repite la angiografía para documentar la permeabilidad del vaso. Después de la angiografía, todos los catéteres y las vainas se retiran y la porción proximal de la arteria carótida derecha común ligado es, el músculo y la fascia se sutura con una sutura 4 / 0 absorbible, y la incisión de la piel se cerró con un 4 / 0 sutura no absorbible.
5. El animal se deja recuperar con la administración de una dosis de antibióticos (cefazolina, 0,5 gramos de mensajería instantánea). Medicamentos para el dolor incluyendo IM 0,01 mg / kg de buprenorfina (dos veces al día, según sea necesario). Los animales son luego continuó el 1% de colesterol durante 4 semanas post-globo denudación. En la semana 5, los animales son la transición a la dieta de colesterol al 0,3%.

Integrada multi-modal de imágenes de Rabbit Atheromata

2) El etiquetado de placa inflamada proteolíticamente activa con nanosensor inyectables, angiografía, ultrasonido intravascular (IVUS), y en vivo intravascular NIRF imágenes de ateroma de conejo

1. Ocho semanas después de la lesión con balón y 24 horas antes de la imagen, el conejo se inyecta por vía intravenosa con 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) a través de vena de la oreja.
2. Veinticuatro horas después de la inyección, los animales son anestesiados y el acceso arterial se obtiene a través de la arteria carótida común (véase el paso 1.2). Intraarterial se administra heparina (150 U / kg). De referencia la angiografía se obtiene que el anterior.
3. Un catéter de IVUS se carga en una clínica coronaria capaz 0,014 pulgadas de alambre y se inserta en la vaina. Usando la guía fluoroscópica, la punta del hilo radiopaco se coloca distal a la arteria ilíaca derecha. El catéter de IVUS se avanzó entonces en la arteria ilíaca proximal utilizando una técnica estándar clínico monorraíl.
4. Un retroceso de 100 mm se inicia y las imágenes se registran. Reconstrucción longitudinal del buque se obtiene y la placa luminal se identifica.
5. El catéter NIRF ^11,12 cargado en el alambre de 0,014 pulgadas (monorraíl del sistema), y el catéter se inserta cuidadosamente en la vaina y el cabezal de exposición está situado distalmente en la arteria ilíaca derecha.
6. Múltiples retrocesos automatizado (1 mm / seg retroceso longitudinal, 30 disparos por minuto) se llevan a cabo y las señales de fluorescencia dentro de las zonas de la aterosclerosis es anotada. Las imágenes se graban y el tratamiento posterior con la escala adecuada y ventanas en función del alcance de la señal se logra.

3) La eutanasia y el aislamiento de los ex vivo aorto-ilíacos tejido

1. La eutanasia se lleva a cabo con 1 cc de agente de la eutanasia (solución de fenitoína sódica 390mg de sodio pentobarbital y 50 mg), la inyección intravenosa, sola.
2. El árbol arterial es perfundido con solución salina normal al 0,9% hasta la vena cava inferior es de la sangre. Las arterias ateroscleróticas aorta e ilíaca se identifican y se diseca de los tejidos circundantes. Además, las pequeñas piezas de 2 x 2 cm de liver, los riñones, el bazo y el corazón también se obtienen.
3. Ex vivo NIRF de imágenes con el catéter intravascular NIRF imágenes se puede hacer en esta etapa. El buque es alargada y el catéter NIRF se reinserta en la aorta proximal hasta que la cabeza de imágenes se coloca en la arteria ilíaca derecha o bifurcación. Múltiples retrocesos automatizados se llevan a cabo como anteriormente (véase 2.6).

4) ex vivo de fluorescencia de reflectancia de imágenes (FRI) de la aorta disecada y las arterias ilíacas

1. Los tejidos disecados está situado en el 10-20 cc de solución fisiológica y se transportan para el análisis de vie (Kodak Image Pro Estación de 4000mm, Carestream Health, Inc.).
2. Aorta, vasos ilíacos son alargadas para aproximar en tiempo real longitudes y se obtienen imágenes en varias longitudes de onda [luz blanca, el canal verde fluorescente (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) y Cy7 (ex 650 nm, 760 nm em)] canales. Una serie de tiempos de exposición se utilizan para cada longitud de onda (0.1-30seg) y las imágenes obtenidas se exportan como DICOM o 16-bit TIFF sin escala para otros análisis. Como controles positivos y negativos, los órganos (hígado, bazo, riñón y corazón) son fotografiados en canales similares y tiempos de exposición.
3. Áreas de aumento de la señal en el canal infrarrojo cercano (780nm +) se observan en las arterias ateroscleróticas.

5) Incorporación de tejidos para el análisis de sección y de inmunohistoquímica

1. Áreas de la normalidad (sin lesiones de tejidos, es decir, la arteria ilíaca izquierda) y zonas de la placa de identificación y pequeños anillos de 5-10 mm de tejido están incrustadas en octubre (la temperatura óptima de corte) los medios de comunicación. Los bloques se almacenan a -80 C hasta el corte.
2. Técnicas estándar para el análisis inmunohistoquímico de seccionamiento y se llevan a cabo. Hematoxilina y eosina, Ram-11 y la tinción de la catepsina B se llevan a cabo.

Los análisis e integración de multi-modal imágenes (angiografía, IVUS, NIRF y FRI)

6) El procesamiento de imágenes NIRF y el FRI

1. Archivos DICOM contienen datos de imágenes de NIRF y el FRI (tomada en cerca del canal infrarrojo 780 nm) retiradas se procesan utilizando MATLAB y software Osirix, respectivamente. Ventanas adecuado para mostrar amplia gama de intensidad de la señal se logra. Las imágenes finales se exportan como archivos TIFF.
2. Los archivos se importan en el software estándar de procesamiento de imágenes (Keynote se puede utilizar). Las imágenes se alinean sobre la base de puntos de referencia (es decir, las vértebras en la angiografía, la bifurcación ilíaca y la arteria renal). Las áreas de vaso normal y la placa se identifican.
3. Las regiones de interés (ROI) de forma manual trazado (por el tejido normal y áreas de la placa) y la media de intensidad de la señal son adquiridos mediante Osirix y MATLAB, respectivamente, para ambos vie e imágenes NIRF. Para guiar el seguimiento adecuado, la imagen IVUS longitudinal del buque se utiliza y la identificación de vaso normal y la placa son fácilmente identificables.
4. Al objetivo de fondo (RBT) ratios se calculan para las zonas de la placa.

Los resultados representativos:

Una vez finalizado el protocolo anterior, podemos identificar y caracterizar las áreas de la actividad aumentada de la proteasa catepsina en la placa inflamatoria en la aorta y los vasos ilíacos. La inyección de un nanosensor activable (Prosense/VM110) que nos permite identificar la placa proteolíticamente activa. Estos aparecen como zonas brillantes o señal intensa en imágenes utilizando vie en el canal infrarrojo cercano (750 nm). Los retrocesos NIRF se correlacionan con la intensidad de la señal aumentó FRI y alineaciones con IVUS que permiten el registro de las señales anatómicas NIRF. TBR calcula la placa, obtenidos a partir de vie y NIRF fueron similares (véase la Figura 3: media NIRF TBR 4.2, significa vie TBR 2,9). El análisis inmunohistoquímico de la placa brillante confirma la presencia intensa de RAM-11 y la actividad de la catepsina B en las áreas de la placa (datos no mostrados).

Figura 1. Esquemática de 2D catéter NIRF Para ampliar el potencial clínico de un enfoque 1D NIRF detección ^6, se construyó una novela en 2-D NIRF-catéter intravascular para la imagen. ^11,12 El catéter costumbre-construido consta de una fibra óptica (125 micrones de diámetro ubicado en tubería de polietileno: 2.9F) que se ilumina con un láser de 750 nm fuente de excitación. La luz del láser es emitida en un ángulo de 90 grados respecto al eje de la fibra. El sistema utiliza dos motores automatizados (rotación y de traslación) para permitir imágenes concomitante de 360 ​​grados y retroceso longitudinal para obtener imágenes 2D verdad. Imágenes que se utilizan con permiso de referencia 11.

Figura 2. Esquemático que demuestra la activación mediada por la proteasa del nanosensor, Prosense/VM110. Imagen que se utiliza con permiso de referencia 10.

Figura 3. En vivo y ex vivo TBRs placa (meta-a las relaciones de fondo)

Discusión

Inflamado placas de alto riesgo o vulnerables son probablemente responsables de la mayoría de los infartos de miocardio. La identificación de estas placas antes de la aparición de los síntomas tiene importantes implicaciones clínicas, tanto en la predicción de los resultados y guiar el tratamiento médico. Modalidades convencionales de imagen coronaria arterial, tales como la angiografía de rayos X normalmente se centran en la caracterización de estrechamiento luminal en lugar de iluminar los perfiles biológicos subyacen...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Prosense 750	Visen Medical	VM110	inyección IV de 500 nmol/kg
Heparina sódica	APP Pharmaceuticals	401586D
Cefazolina	NovaPlus	46015683
Lidocaína HCL al 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorfina	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamina	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
Dieta alta en colesterol al 1%	Research Diets	C30293
Dieta alta en colesterol al 0,3%	Research Diets	C30255