El modelo de ratón de En el útero El trasplante es una herramienta versátil que puede usarse para estudiar las posibles aplicaciones clínicas de trasplante de células madre y terapia génica en el feto. En este protocolo, se presenta un enfoque general a la realización de esta técnica
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Artículo de método
Un modelo de ratón En el útero Trasplante
En este artículo
Resumen
Resumen
El trasplante de células madre en el útero y el virus tiene un enorme potencial para el tratamiento de alteraciones congénitas en el feto humano. Por ejemplo, en el útero de trasplante (IUT) de las células madre hematopoyéticas se ha utilizado con éxito para tratar pacientes con inmunodeficiencia combinada severa 1,2. En otras condiciones, sin embargo, IUT se ha intentado sin éxito. 3 Teniendo en cuenta estos resultados mixtos, la disponibilidad de un sistema eficiente no humanos modelo para estudiar las secuelas biológicas del trasplante de células madre y terapia génica es fundamental para avanzar en este campo. Nosotros y otros han utilizado el modelo de ratón de la UIT para estudiar los factores que afectan de éxito del injerto en el útero trasplantado células madre hematopoyéticas, tanto en ratones de tipo salvaje 4-7 y personas con enfermedades genéticas. 8,9 El ambiente fetal también ofrece ventajas para el éxito de la terapia génica in utero. Por ejemplo, la entrega de adenovirus 10, adeno-asociado viral 10, 11 antirretrovirales, y los vectores lentiviral 12,13 en el feto ha dado lugar a la transducción de múltiples órganos distantes del sitio de la inyección con la expresión genética a largo plazo. En el útero por lo tanto, la terapia génica puede ser considerada como una posible estrategia de tratamiento para los trastornos de un único gen, como la distrofia muscular o fibrosis quística. Otra ventaja potencial de IUT es la capacidad de inducir tolerancia inmunológica a un antígeno específico. Como se ha visto en ratones con hemofilia, la introducción del factor IX a principios de los resultados del desarrollo de la tolerancia a esta proteína 14.
Además de su uso en la investigación de terapias potenciales humanos, el modelo de ratón de IUT puede ser una poderosa herramienta para estudiar las cuestiones básicas de la biología celular y del desarrollo del tallo. Por ejemplo, se puede ofrecer varias moléculas pequeñas para inducir o inhibir la expresión de genes específicos en etapas definidas gestacional y manipular las vías de desarrollo. El impacto de estas alteraciones puede ser evaluado en los puntos de tiempo diferentes después del trasplante inicial. Además, se puede trasplantar células pluripotentes específicas o linaje progenitor en el medio ambiente fetal para estudiar la diferenciación de células madre en un entorno de acogida no irradiados y sin inmutarse.
El modelo de ratón de IUT ya ha proporcionado información numerosas en el campo de la inmunología, biología celular y del desarrollo y el tallo. En este protocolo basado en video, se describe un enfoque paso a paso para realizar el IUT de fetos de ratones y delinear los pasos críticos y peligros potenciales de esta técnica.
Protocolo
1. Preparación de pipetas de inyección
- Calibrar el extractor de la pipeta de modo que la separación de la pipeta de vidrio se produce en 15 segundos (vea las instrucciones del fabricante con respecto a la calibración). La pipeta se tiene una forma cónica que se separa.
- Corte el extremo de la pipeta de modo que la distancia desde el inicio de la puesta a punto hasta el final de la pipeta se 1.04cm de 1.05cm. La longitud de la pipeta es inversamente proporcional a la talla del orificio de la pipeta. Tenga en cuenta que la toma de una pipeta ya también se traduce en una punta más débil que es más susceptible a la rotura durante la inyección.
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Discusión
Más de 50 años, Billingham, Brent y Medawar utilizados en el útero de trasplante en ratones para inducir tolerancia inmunológica a proteínas extrañas. 16 Desde entonces, diversas variantes de esta técnica se han utilizado para tratar las cuestiones de la inmunología y la biología de células madre.
El protocolo detallado aquí es uno de los métodos más accesibles para los IUT. El hígado fetal ofrece un blanco fácil de visualizar y proporciona acceso a la circulación sistémi.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Queremos agradecer a nuestras fuentes de financiamiento: El Instituto de Medicina Regenerativa de California Clínica Fellow de Formación Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), Colegio Americano de Cirujanos (MTC), la American Pediatric Surgical Association ( MTC), y la March of Dimes (TCM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipetas | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Extractor de pipetas | Sutter Instrument Co. | Modelo P-30 | |
| Microinyector | Narishige International | IM-300 | |
| Afilador de pipetas | Sutter Instrument Co. | Modelo BV-10 |
Referencias
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S.
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Reimpresiones y permisos
