La capacidad de producir transgenes de Caenorhabditis elegans Utilizando ADN genómico realizado por fosmids es particularmente atractivo ya que todos los elementos de regulación nativos se mantienen. Descrito es un procedimiento sencillo y robusto para la producción de transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador de selección.
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Artículo de método
La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La creación de animales transgénicos se utiliza ampliamente en C. elegans de investigación, incluyendo el uso de proteínas de fusión GFP para estudiar la regulación y el patrón de expresión de genes de interés o de generación de purificación por afinidad en tándem (TAP) etiquetados versiones de genes específicos para facilitar su purificación. Normalmente, los transgénicos son generados por la colocación de un promotor aguas arriba de un gen reportero GFP o cDNA de interés, y esto a menudo produce un patrón de expresión representativa. Sin embargo, los elementos críticos de la regulación génica, tales como elementos de control en la región 3 'no traducida o promotores alternativos, podría perderse por este enfoque. Además sólo una variante de empalme solo puede ser estudiado por lo general por este medio. En contraste, el uso del ADN del gusano genómico realizado por clones de ADN fosmid probablemente incluye a la mayoría si no todos los elementos que intervienen en la regulación génica in vivo que permite la mayor capacidad de capturar el patrón de expresión genuina y el calendario. Para facilitar la generación de transgenes utilizando ADN fosmid, se describe una E. coli procedimiento basado en recombinería para insertar las buenas prácticas agrarias, un TAP-tag, u otras secuencias de interés en cualquier lugar en el gen. El procedimiento utiliza el gen GALK como el marcador de selección, tanto para los pasos de selección positiva y negativa en recombinería lo que se traduce en la obtención de la modificación deseada con gran eficiencia. Además, los plásmidos que contienen el gen GALK flanqueado por los brazos de homología con las buenas prácticas agrarias de uso común y TAP genes de fusión están disponibles que reducen el costo de oligos en un 50% cuando se genera una proteína de fusión GFP o TAP. Estos plásmidos utilizar el origen de replicación R6K que se opone a la necesidad de purificación extensa producto de la PCR. Por último, también demuestra una técnica para integrar el marcador unc-119 a la columna vertebral fosmid que permite que el fosmid que se inyecta directamente o bombardeados en gusanos para generar animales transgénicos. Este video muestra los procedimientos involucrados en la generación de un transgén por recombinería usando este método.
Protocolo
Información general
Transgenes muchas utilizados en la generación de transgénicos C. elegans consisten en secuencias de promotor y tal vez un gen de ADNc clonado en uno de los vectores generados por el laboratorio del Dr. Andy Fuego 1. Si bien estos transgenes a menudo son exitosos en lo que respecta a la producción de un gen reportero GFP o expresar un ADNc en un modelo deseado, los transgenes pueden carecer de los promotores alternativos, elementos potenciadores, y 3 'región sin traducir (UTR) los elementos que juegan un papel importante en el control de la expresión génica in vivo 2. Por ejempl....
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Discusión
La generación de los transgenes de fosmids ofrece la ventaja de conservar todos los elementos promotor nativo, las variantes de empalme, y 3 'UTR elementos reguladores. Esto puede conducir a la construcción de un transgén que es más un reflejo de los patrones de expresión nativa, o la construcción de un transgén funcional cuando otros métodos fallan 5. Los transgenes resultante puede llevar a una variedad de etiquetas epítopo incluyendo GFP o una etiqueta de TAP.
La construcci.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Lindsey Nash en busca de ayuda con el desarrollo de la técnica. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención AG028977 a ALF, una subvención para el proyecto piloto de la Universidad de Pittsburgh OAIC (AG024827), y los fondos de las semillas de la Universidad de Pittsburgh.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit FosmidMAX | Epicentre Biotechnologies | FMAX046 | |
| GoTaq | Promega Corp. | M7122 | |
| Medio MOPS | TEKnova, Inc. | M2120 | |
| Solución de fosfato de potasio 0,132 M | TEKnova, Inc. | M2102 | |
| D-galactosa | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 2-desoxigalactosa | Sigma-Aldrich | D4407 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Leucina | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Polimerasa Phusion de ADN | New England Biolabs | F-530S | |
| Base de agar MacConkey | BD Biosciences | 281810 | |
| Arafinosa | Sigma-Aldrich | A3131 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 |
Referencias
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119....
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Reimpresiones y permisos
